一种用于检测巨噬细胞中 TLR 依赖性 NF-κB/AP-1 转录因子信号通路的实验方法

摘要

来源：McKiel, L. A.， 等 一种用于在聚合物表面吸附蛋白层上研究Toll样受体介导的NF-κB/AP-1信号通路的巨噬细胞报告细胞检测方法。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种检测巨噬细胞中Toll样受体（TLR）依赖性转录因子核因子κB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1）活性的实验方法。当TLR识别损伤相关分子模式（DAMPs）后，会启动促炎性信号级联反应，从而激活NF-κB和AP-1。经基因工程改造的报告巨噬细胞在NF-κB和AP-1激活后会分泌胚胎碱性磷酸酶（SEAP），该酶的活性可被检测 通过 显色反应。

方案

1. 培养基与试剂的配制

1. 准备成纤维细胞培养基。将450 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素/链霉素混合。4 °C保存，可保存长达3个月。
2. 以50 mL分装量制备报告巨噬细胞生长培养基。将45 mL DMEM、5 mL FBS、5 μg/mL支原体清除试剂（材料表）和200 μg/mL博来霉素D1（材料表）混合。4 °C保存，可保存长达3个月。
3. 以50 mL分装量制备报告巨噬细胞检测培养基。将45 mL DMEM、5 mL热灭活胎牛血清（HI-FBS）、5 μg/mL支原体清除试剂和200 μg/mL博来霉素D1混合。4 °C保存，可保存长达3个月。

2. 使用聚甲基丙烯酸甲酯包被细胞培养表面

1. 在20 mL玻璃闪烁瓶中，将聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）溶于氯仿，配制成20 mg/mL的溶液（例如，100 mg PMMA溶于5 mL氯仿）。在瓶中放入磁力搅拌子，搅拌至少2小时，直至所有固体完全溶解。
   注意：氯仿吸入有害。务必在通风橱内操作，并佩戴PVA手套使用溶剂。
2. 使用移液器将400 µL PMMA溶液加至旋涂仪中硼硅酸盐玻璃载....

结果

图1：在TCPS、PMMA、PDMS和fPTFE上培养的NF-κB/AP-1报告巨噬细胞的碱性磷酸酶检测方法与结果。（A）报告巨噬细胞碱性磷酸酶检测的工作流程示意图。（B）裂解物的Western blot结果，证实DAMP分子HMGB1和HSP60的存在，以β-actin作为上样对照。（C）报告巨噬细胞在培养基（阴性对照）、10% FBS、裂解物和Pam3CSK4（TLR2配体，阳性对照）中培养20小时后的NF-κB/AP-1活性（以吸光度表示）。数据展示了一次实验的结果，该结果代表至少两次独立实验的典型数据，以均值±标准差（SD）表示。每次实.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养试剂
抗小鼠/人 CD282 (TLR2)	Biolegend	121802
CLI-095 (TLR4 抑制剂)	Invivogen	TLRL-CLI95
C57 补体血浆 K2 EDTA 10ml，创新级，美国来源	InnovativeResearch	IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml	小鼠血浆
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)	Sigma Aldrich	D6429-500ML
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (DPBS)	Fisher Scientific	14190250	无钙、无镁
胎牛血清 (FBS)，研究级	Wisent	98150
LPS-EK	Invivogen	TLRL-EKLPS	来自大肠杆菌 K12 的脂多糖
NIH/3T3 成纤维细胞	ATCC	CRL-1658
Pam3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	合成三酰化脂肽 - TLR1/2 配体
青霉素/链霉素	Sigma Aldrich	P4333-100ML
Plasmocin	Invivogen	ANT-MPP	支原体清除试剂
RAW-Blue 细胞	Invivogen	raw-sp	NF-κB/AP-1 报告巨噬细胞系
台盼蓝溶液，0.4%	Fisher Scientific	15250061
TrypLE express 酶 (1X)	Fisher Scientific	12604021	无动物来源的重组细胞解离酶
Zeocin	Invivogen	ANT-ZN-1
试剂盒与检测试剂
ELISA 预包被板，小鼠 IL-6	Biolegend	B213022
ELISA 预包被板，小鼠 TNF-α	Biolegend	B220233
内毒素（大肠杆菌）- 控制标准内毒素 (CSE)	Associates of Cape Cope Inc.	E0005-5	显色法内毒素检测标准曲线用内毒素
LAL 用水，100 mL	Associates of Cape Cope Inc.	WP1001	用于显色法内毒素检测
微定量 BCA 蛋白检测试剂盒	Fisher Scientific	PI23235
鲎变形细胞裂解物 (LAL) Pyrochrome 内毒素检测试剂盒	Associates of Cape Cope Inc.	C1500-5	显色法内毒素检测试剂
QUANTI-Blue 碱性磷酸酶检测培养基	Invivogen	rep-qb2	通过间接测量碱性磷酸酶活性来评估 NF-κB/AP-1 活性
聚合物涂层试剂
氯仿，无水	Sigma Aldrich	288306-1L
乙醇，无水	Commercial Alcohols	P006EAAN	Sigma：试剂级乙醇，无水，676829-1L
直型锥形细尖镊子	Fisher Scientific	16-100-113
Fluorinert FC-40 溶剂	Sigma Aldrich	F9755-100ML	fPTFE 用氟化溶剂
细胞培养级水（无内毒素）	Fisher Scientific	SH30529LS
聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)	Sigma Aldrich	182230-25G
Sylgard 184 弹性体试剂盒	Fisher Scientific	50822180
特氟龙-AF (fPTFE)	Sigma Aldrich	469610-1G	聚[4,5-二氟-2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环戊烯-共-四氟乙烯]
耗材
粘性板密封膜	Fisher Scientific	AB-0580
Axygen 微量离心管，1.5 mL	Fisher Scientific	14-222-155
硼硅酸盐玻璃闪烁瓶，带白色聚丙烯盖	Fisher Scientific	03-337-4
透明聚苯乙烯 48 孔板	Fisher Scientific	08-772-52
透明组织培养聚苯乙烯 96 孔板	Fisher Scientific	08-772-2C
透明组织培养聚苯乙烯 48 孔板	Fisher Scientific	08-772-1C
盖玻片，圆形	Fisher Scientific	12-545-81
Falcon 组织培养处理过的培养瓶，T25	Fisher Scientific	10-126-10
sticky-Slide 8 孔板	Ibidi	80828
Superfrost 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
组织培养处理过的培养瓶，T150	Fisher Scientific	08-772-48