一种用于检测巨噬细胞中 TLR 依赖性 NF-κB/AP-1 转录因子信号通路的实验方法

摘要

来源：McKiel, L. A.， 等 一种用于在聚合物表面吸附蛋白层上研究Toll样受体介导的NF-κB/AP-1信号通路的巨噬细胞报告细胞检测方法。J. Vis. Exp. (2020)。

本视频展示了一种检测巨噬细胞中Toll样受体（TLR）依赖性转录因子核因子κB（NF-κB）和激活蛋白-1（AP-1）活性的实验方法。当TLR识别损伤相关分子模式（DAMPs）后，会启动促炎性信号级联反应，从而激活NF-κB和AP-1。经基因工程改造的报告巨噬细胞在NF-κB和AP-1激活后会分泌胚胎碱性磷酸酶（SEAP），该酶的活性可被检测 通过 显色反应。

方案

1. 培养基与试剂的配制

1. 准备成纤维细胞培养基。将450 mL的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）、50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL青霉素/链霉素混合。4 °C保存，可保存长达3个月。
2. 以50 mL分装量制备报告巨噬细胞生长培养基。将45 mL DMEM、5 mL FBS、5 μg/mL支原体清除试剂（材料表）和200 μg/mL博来霉素D1（材料表）混合。4 °C保存，可保存长达3个月。
3. 以50 mL分装量制备报告巨噬细胞检测培养基。将45 mL DMEM、5 mL热灭活胎牛血清（HI-FBS）、5 μg/mL支原体清除试剂和200 μg/mL博来霉素D1混合。4 °C保存，可保存长达3个月。

2. 使用聚甲基丙烯酸甲酯包被细胞培养表面

1. 在20 mL玻璃闪烁瓶中，将聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）溶于氯仿，配制成20 mg/mL的溶液（例如，100 mg PMMA溶于5 mL氯仿）。在瓶中放入磁力搅拌子，搅拌至少2小时，直至所有固体完全溶解。
   注意：氯仿吸入有害。务必在通风橱内操作，并佩戴PVA手套使用溶剂。
2. 使用移液器将400 µL PMMA溶液加至旋涂仪中硼硅酸盐玻璃载玻片的中心，以3000 rpm转速旋涂2分钟。根据实验所需数量制备载玻片，并额外准备3−5片用于水接触角测量。将载玻片存放于洁净盒中（用70%乙醇喷洒并擦拭），以备后续使用。
   注意：旋涂常用于在平坦表面沉积一层薄而均匀的涂层。旋涂仪通过高速旋转基底，利用离心力将涂覆液均匀铺展在表面。
   1. 使用接触角测量仪，在额外制备的涂层载玻片表面随机选取两个位置测量水接触角，以确认玻璃表面已完全被聚合物覆盖。
      ​注意：水接触角测量应使用最高纯度的水（例如，玻璃三重蒸馏水）。
3. 在生物安全柜（BSC）中，使用无菌镊子按照无菌操作技术将8孔粘性小室固定在PMMA涂层载玻片上。用力按压粘性小室顶部，确保其牢固粘附。将带有粘性小室的载玻片于37 °C孵育过夜，以确保密封性。
   1. 通过向每个小室加入200 µL细胞培养级（无内毒素）水来测试粘性小室的密封性。室温（RT）孵育60分钟，确认无泄漏后方可继续操作。吸除水分时注意避免破坏PMMA涂层。
4. 在使用前，通过向每个小室加入300 µL无内毒素水，分别孵育1小时（三次）、12小时和24小时，进行无内毒素水清洗，以去除残留溶剂。
5. 检测用于细胞培养的载玻片的内毒素浓度。在每张载玻片的一个小室中加入200 µL无内毒素试剂水（材料表），孵育1小时。使用终点显色法内毒素检测试剂盒（材料表）测定提取液中的内毒素浓度。
   注意：以下方案专用于材料表中所列的内毒素检测试剂盒。
6. 本实验中仅可使用经认证为无热原（即无内毒素）的水和耗材（如移液器吸头、微量离心管和孔板）。此外，用于制备聚合物涂层表面的任何玻璃器皿在使用前均应通过干热灭菌法（250 °C，30分钟）进行去热原处理。如本处所述，在提取液中检测内毒素可能导致对材料表面内毒素水平的低估。因此，建议在开发聚合物涂层方案时，直接在含有涂层样品的小室中进行内毒素检测反应（即对测试样品[试剂水]或加标对照执行步骤2.6.4−2.6.6），以确保在涂层过程中不会无意引入内毒素污染源。
   1. 将所有测试样品（即提取液）和内毒素检测试剂恢复至室温（RT）。用检测缓冲液重悬显色试剂，用试剂水溶解内毒素标准品，溶解5分钟并轻轻混匀后再使用。不使用时，所有试剂瓶均需用石蜡膜覆盖。
   2. 通过在试剂水中对内毒素标准品进行系列稀释，配制包含5−8个点的标准曲线，浓度范围应覆盖检测方法的下限至上限。
   3. 为控制测试样品中内毒素检测可能存在的增强或抑制效应，通过将已知量的内毒素稀释于未使用的测试样品溶液中，制备阳性对照（也称为加标对照或加标样品）。
      注意：阳性对照的浓度应与标准曲线中段某一标准品浓度相同。若加标内毒素的回收量（即阳性对照浓度减去未加标测试样品浓度）在加标量标称浓度的50−200%范围内，则可认为提取液对检测无显著干扰。
   4. 向96孔板的每个孔中以双复孔或三复孔形式加入50 µL标准品、样品或加标对照。以试剂水作为空白对照。
   5. 向每个孔中快速加入50 µL显色试剂。使用计时器记录向所有孔加完试剂所需的时间。加完后用压敏封板膜封板，于37 °C孵育（孵育时间依试剂批次而定，具体见显色试剂盒附带的分析证书）。或者，在孵育期间每15分钟检查一次，直至所有标准品孔均出现颜色变化。
   6. 孵育结束后，向每个孔中加入25 µL 50%乙酸（终浓度为每孔10%乙酸）以终止反应。加入乙酸的顺序应与加入显色试剂的顺序一致。使用酶标仪在405 nm波长读取吸光度。吸除液体后弃去孔板。
      注意：加入乙酸的时间应与加入显色试剂的时间相近（±30秒）。
7. 在进行细胞培养实验前，将载玻片进行30分钟紫外（UV）灭菌。

3. 从3T3细胞制备裂解液

1. 将3T3细胞在多个T150培养瓶中培养至70%融合度。消化细胞时，吸除培养基，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞表面，随后吸除PBS。加入5 mL无动物来源成分的重组细胞解离酶（材料表），于37 °C孵育3−5分钟。
2. 通过轻轻前后倾斜培养瓶使细胞脱落。加入5 mL PBS以中和用于细胞解离的重组酶。将脱落的细胞从培养瓶转移至离心管中，并用移液器吹打混匀。使用血细胞计数板和活细胞染色剂进行活细胞计数。
   注意：选用可通过PBS稀释中和的细胞解离酶，以避免在裂解液制备过程中引入血清来源蛋白。若使用胰蛋白酶消化细胞，则需用含血清的溶液进行中和，并额外进行一次PBS洗涤，以减少血清蛋白带入裂解液。
3. 以200 × g离心5分钟。吸除上清液，并用原始体积的PBS（即每瓶10 mL × 培养瓶数量）重悬细胞，以洗去残留培养基。重复一次。
4. 再次以200 × g离心5分钟，吸除上清液。加入适量PBS，使最终细胞浓度达到1 × 10⁶ 个细胞/mL。将细胞悬液置于-80 °C冰箱中冷冻，直至样品完全冻结（至少2小时）。
5. 将细胞悬液在37 °C水浴中解冻。完全解冻后，重新放回-80 °C冰箱中直至完全冻结。共重复3次冻融循环。
6. 对细胞裂解液进行多种稀释度（如1/100、1/200、1/500、1/1000）的微量双辛可宁酸（BCA）蛋白定量检测，以确定蛋白浓度。将细胞裂解液稀释至蛋白浓度为468.75 µg/mL，分装后于-80 °C保存以备后续使用。
   注意：在48孔板中，最终蛋白浓度为125 µg/cm²（基于单个孔的表面积0.75 cm²计算）。
7. 通过Western blot检测裂解液中损伤相关分子模式分子（DAMPs）的存在情况（例如热休克蛋白60 [HSP60]、高迁移率族蛋白B1 [HMGB1]），将40−60 µg裂解液蛋白加入上样缓冲液，上样至厚度为1.5 mm的10%聚丙烯酰胺凝胶，随后按照标准Western blot流程操作。

4. 评估吸附蛋白层和Toll样受体对巨噬细胞NF-κB活性的影响

注意： 实验流程示意图和培养板布局分别参见图1A和图2。

1. 将报告基因巨噬细胞在适当大小的培养瓶中培养至70%融合度。吸除培养基，用PBS洗涤表面，再吸除PBS。加入重组细胞解离酶，于37 °C孵育8分钟。
2. 通过用力轻敲培养瓶侧面使细胞脱落。加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的生长培养基以终止重组细胞解离酶的作用。使用血细胞计数板和活细胞染色剂进行活细胞计数。
   注意：报告基因巨噬细胞经8分钟细胞解离酶孵育后，预期存活率应为90%。
3. 以200 × g离心5分钟。吸除上清液，并用原始体积的PBS重悬细胞以洗涤。再次离心后，将细胞重悬于检测培养基（含热灭活FBS）中，浓度为7.3 × 10⁵ 个细胞/mL。
4. 将细胞悬液分装至3个不同的离心管中：TLR4抑制剂组、抗TLR2抗体组和未处理组。分别在室温下用1 µg/mL TLR4抑制剂孵育60分钟，或用50 µg/mL抗TLR2抗体孵育30分钟。
5. 向48孔板（或等效板）中每孔加入200 µL裂解液、10% FBS、10%商用小鼠血浆（材料表）或蛋白溶液混合物，于37 °C孵育所需时间（例如30分钟、60分钟或24小时），使蛋白吸附。使用新的巴斯德吸管逐孔吸除蛋白溶液，每孔用250 µL PBS洗涤5分钟，随后吸除PBS。重复洗涤共3次。
   注意：根据所需的吸附时间，此步骤可能需要在实验流程早期开始。请相应调整实验流程。
6. 在TLR4抑制剂或抗TLR2抗体孵育结束后，用移液器吹打使细胞重悬。向每个孔中加入200 µL细胞悬液。
7. 对于TLR2阳性对照组，加入Pam3CSK4（Pam3Cys-Ser-(Lys)4），终浓度为150 ng/mL；对于TLR4阳性对照组，加入脂多糖（LPS），终浓度为1.5 µg/mL。于37 °C孵育细胞20小时。
8. 从每个孔中取20 µL上清液，重复加样至96孔板中。设置三孔仅含20 µL检测培养基作为空白背景对照。每孔加入200 µL SEAP报告基因检测试剂。用粘性封板膜封板，于37 °C孵育2.5小时。
   注意：孵育时间可能因实验条件而异，应优化至阳性与阴性对照孔之间的吸光度差异显著。
   1. 将剩余上清液转移至1.5 mL离心管（每孔一管）。以1,000 × g离心10分钟以沉淀残渣。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，并于-80 °C保存。通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析上清液中促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6）的存在情况。
9. 移除粘性封板膜。使用酶标仪在635 nm波长处读取吸光度。吸除液体并丢弃板。

结果

图1：在TCPS、PMMA、PDMS和fPTFE上培养的NF-κB/AP-1报告巨噬细胞的碱性磷酸酶检测方法与结果。（A）报告巨噬细胞碱性磷酸酶检测的工作流程示意图。（B）裂解物的Western blot结果，证实DAMP分子HMGB1和HSP60的存在，以β-actin作为上样对照。（C）报告巨噬细胞在培养基（阴性对照）、10% FBS、裂解物和Pam3CSK4（TLR2配体，阳性对照）中培养20小时后的NF-κB/AP-1活性（以吸光度表示）。数据展示了一次实验的结果，该结果代表至少两次独立实验的典型数据，以均值±标准差（SD）表示。每次实...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养试剂
抗小鼠/人 CD282 (TLR2)	Biolegend	121802
CLI-095 (TLR4 抑制剂)	Invivogen	TLRL-CLI95
C57 补体血浆 K2 EDTA 10ml，创新级，美国来源	InnovativeResearch	IGMSC57-K2 EDTA-Compl-10ml	小鼠血浆
杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)	Sigma Aldrich	D6429-500ML
杜尔贝科磷酸盐缓冲液 (DPBS)	Fisher Scientific	14190250	无钙、无镁
胎牛血清 (FBS)，研究级	Wisent	98150
LPS-EK	Invivogen	TLRL-EKLPS	来自大肠杆菌 K12 的脂多糖
NIH/3T3 成纤维细胞	ATCC	CRL-1658
Pam3CSK4	Invivogen	tlrl-pms	合成三酰化脂肽 - TLR1/2 配体
青霉素/链霉素	Sigma Aldrich	P4333-100ML
Plasmocin	Invivogen	ANT-MPP	支原体清除试剂
RAW-Blue 细胞	Invivogen	raw-sp	NF-κB/AP-1 报告巨噬细胞系
台盼蓝溶液，0.4%	Fisher Scientific	15250061
TrypLE express 酶 (1X)	Fisher Scientific	12604021	无动物来源的重组细胞解离酶
Zeocin	Invivogen	ANT-ZN-1
试剂盒与检测试剂
ELISA 预包被板，小鼠 IL-6	Biolegend	B213022
ELISA 预包被板，小鼠 TNF-α	Biolegend	B220233
内毒素（大肠杆菌）- 控制标准内毒素 (CSE)	Associates of Cape Cope Inc.	E0005-5	显色法内毒素检测标准曲线用内毒素
LAL 用水，100 mL	Associates of Cape Cope Inc.	WP1001	用于显色法内毒素检测
微定量 BCA 蛋白检测试剂盒	Fisher Scientific	PI23235
鲎变形细胞裂解物 (LAL) Pyrochrome 内毒素检测试剂盒	Associates of Cape Cope Inc.	C1500-5	显色法内毒素检测试剂
QUANTI-Blue 碱性磷酸酶检测培养基	Invivogen	rep-qb2	通过间接测量碱性磷酸酶活性来评估 NF-κB/AP-1 活性
聚合物涂层试剂
氯仿，无水	Sigma Aldrich	288306-1L
乙醇，无水	Commercial Alcohols	P006EAAN	Sigma：试剂级乙醇，无水，676829-1L
直型锥形细尖镊子	Fisher Scientific	16-100-113
Fluorinert FC-40 溶剂	Sigma Aldrich	F9755-100ML	fPTFE 用氟化溶剂
细胞培养级水（无内毒素）	Fisher Scientific	SH30529LS
聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)	Sigma Aldrich	182230-25G
Sylgard 184 弹性体试剂盒	Fisher Scientific	50822180
特氟龙-AF (fPTFE)	Sigma Aldrich	469610-1G	聚[4,5-二氟-2,2-双(三氟甲基)-1,3-二氧杂环戊烯-共-四氟乙烯]
耗材
粘性板密封膜	Fisher Scientific	AB-0580
Axygen 微量离心管，1.5 mL	Fisher Scientific	14-222-155
硼硅酸盐玻璃闪烁瓶，带白色聚丙烯盖	Fisher Scientific	03-337-4
透明聚苯乙烯 48 孔板	Fisher Scientific	08-772-52
透明组织培养聚苯乙烯 96 孔板	Fisher Scientific	08-772-2C
透明组织培养聚苯乙烯 48 孔板	Fisher Scientific	08-772-1C
盖玻片，圆形	Fisher Scientific	12-545-81
Falcon 组织培养处理过的培养瓶，T25	Fisher Scientific	10-126-10
sticky-Slide 8 孔板	Ibidi	80828
Superfrost 显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
组织培养处理过的培养瓶，T150	Fisher Scientific	08-772-48