一种用于评估CAR T细胞效力的实时体外细胞溶解检测方法

摘要

来源：Xi, B. 等，靶向实体瘤和血液系统肿瘤细胞的嵌合抗原受体T细胞实时效价检测方法 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种通过实时电学阻抗测量来监测CAR T细胞对癌细胞活性的方法。通过追踪阻抗变化，可评估CAR T细胞诱导癌细胞裂解的效果，从而深入了解其细胞毒性能力。

方案

1. CAR编码慢病毒的制备

注意： 特异性嵌合抗原受体（CAR）T细胞质粒构建完成后（如CD47及其他），按照所述方法，使用293 FT细胞、慢病毒包装混合物和转染试剂（参见 材料表）通过标准流程生成慢病毒CAR。随后，使用定量反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒和热循环仪（参见 材料表），根据制造商说明书通过测定慢病毒RNA含量来确定病毒滴度。所有慢病毒操作必须严格遵守安全要求进行。

1. 在150 mm培养皿中接种15 × 10⁶ HEK293FT细胞，使用杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）恒温培养箱中孵育过夜。
2. 准备两个15 mL离心管用于转染复合物。第一个管中加入慢病毒载体质粒DNA（5 µg）和慢病毒包装混合物（22.5 µg），溶于2.5 mL转染稀释液中；第二个管中加入82.5 µL转染试剂，溶于2.5 mL转染稀释液中（参见 材料表）。
3. 将1号管中的内容物用移液器转移至2号管中，室温下孵育15分钟。
4. 将混合液逐滴加入HEK293FT细胞培养皿中，于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）恒温培养箱中继续孵育过夜 。
5. 次日，将原有培养基更换为19 mL新鲜DMEM培养基，并在37 °C、5% CO₂ 恒温培养箱中继续孵育过夜。
6. 将培养皿中的培养基转移至50 mL离心管中，将含有病毒的培养基管置于冰箱中保存。
7. 重复上述操作，再次加入新鲜DMEM培养基，并在1天后收集培养基。
8. 将两次收集的培养基合并至同一离心管中，在4 °C条件下以2,000 × g 离心30分钟。
9. 将大部分含慢病毒的上清液转移至超净离心管中，保留最小体积（约1 mL）的上清液，以避免扰动可能含有细胞和/或碎片的沉淀。
10. 将上述澄清的上清液在4 °C下以110,000 × g 超速离心100分钟。
11. 小心移除上清液，轻柔地向管底病毒沉淀中加入100 µL DMEM培养基，将离心管置于冰上15分钟。轻轻混匀溶液，并将慢病毒溶液分装至预冷的无菌管中。将病毒原液储存于-80 °C冰箱中。
12. 使用定量RT-PCR试剂盒，根据制造商提供的操作说明检测慢病毒滴度，该方法通过提取并测定慢病毒RNA含量实现定量。

2. CAR T 细胞的制备与扩增

1. 用1 mL CAR T细胞培养基重悬先前冻存的人外周血单个核细胞（PBMCs）（约1 x 10⁶ 至2 x 10⁶ 个细胞），加入等数量的CD3/CD28包被的微珠（见 材料表），在37 °C、含5% CO₂ 的湿润培养箱中孵育24小时。
2. 将慢病毒原液分装样品置于冰上解冻。
3. 向含细胞的孔中加入1 µL转导增强剂并混匀。
4. 以感染复数（MOI）5:1的比例将慢病毒加入细胞中，轻轻混匀。次日重复此步骤（即首次转导后24小时）。
5. 每2–3天监测T细胞生长情况，补充新鲜CAR T细胞培养基，使细胞密度维持在1 x 10⁶ 至2 x 10⁶ 个细胞/mL。
6. 使用标准程序及冻存液（见 材料表）对CAR T细胞进行冻存。
7. 采用标准方法解冻CAR T细胞，并在进行实验前，用含白细胞介素-2（IL-2，300单位/mL）的CAR T细胞培养基预培养约2–4小时。

3. 通过流式细胞术检测CAR表达

1. 将 3 × 10⁵ CAR T 细胞和未转导的 T 细胞分别转移至两个独立的 1.5 mL 微量离心管中。
2. 在 300 × g 条件下离心 2 分钟，弃上清，用含 1% 人血清的荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液将细胞重悬于 200 µL 体积中。
3. 用移液器将 100 µL 细胞悬液分别加入两个 5 mL 聚苯乙烯 FACS 管中，冰上放置 5 分钟。
4. 向每种细胞类型的其中一管中加入 1 µL 生物素标记的山羊抗小鼠 F(ab')₂ 抗体；向另一管中加入 2 µL 藻红蛋白（PE）标记的抗标签抗体（见 材料表）。充分混匀后，冰上孵育 30 分钟。
5. 每管中加入 3 mL FACS 缓冲液洗涤细胞，在 300 × g 条件下离心 5 分钟；弃去上清液，短暂涡旋或轻轻振荡管底，利用残留液体重新悬浮细胞。
6. 向每管中加入 2 µL 抗原呈递细胞（APC）标记的抗 CD3 抗体和 2 µL 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）抗体溶液（见 材料表）；对于已用抗 F(ab')₂ 抗体染色的细胞管，额外加入 1 µL PE 标记的链霉亲和素。短暂混匀后，冰上继续孵育 30 分钟。
7. 按照步骤 3.5 所述方法，再次用 FACS 缓冲液洗涤细胞，并向每管中额外加入 200 µL FACS 缓冲液。
8. 使用流式细胞术分析细胞：首先在前向散射光与侧向散射光图中圈选 T 细胞，然后在 CD3 与 7-AAD 图中圈选活细胞（7-AAD 阴性）；最后分析抗标签抗体、抗 ScFv 抗体或抗 F(ab')₂ 抗体与 CD3 的共表达情况。

4. 实时细胞裂解效力检测（RTCA）

注意：请按照制造商推荐的条件进行 RTCA 检测。简言之，首先将靶细胞接种于 E-Plate 的孔中，次日加入 CAR T 细胞。通过实时监测 CAR T 细胞对靶细胞的裂解活性。以 T 细胞和模拟转导的 T 细胞（Mock CAR T 细胞）作为阴性效应细胞对照。以下方案描述了一种针对贴壁肿瘤细胞系的 体外 实时细胞裂解效力检测方法。

1. 向 xCELLigence E-Plate 的每个孔中加入 100 µL 目标细胞培养基，将该板放入 xCELLigence 仪器中，获取背景读数。然后将 E-Plate 转移至组织培养罩内，用于接种细胞。
2. 采用标准方案用胰蛋白酶消化从培养装置中收获目标癌细胞。随后将细胞转移至 15 mL 离心管中，并加入新鲜培养基至 15 mL。在 200 × g 条件下离心 5 分钟以收集细胞。弃去上清液，加入 5 mL 新鲜培养基，使用血清移液管轻轻重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板和显微镜计数活细胞密度。
3. 适当调整细胞密度，然后向 E-Plate 的每个孔中加入 100 µL 细胞悬液。对于贴壁细胞系（如 BxPC3、Hela-CD19 和 SKOV3），目标细胞数量通常约为 10,000 个/孔；对于悬浮细胞（如 Raji 细胞），则为 30,000 个/孔（有关使用抗体预包被孔以固定液体癌细胞的详细信息，请参见下文）。
4. 将 E-Plate 在室温下平衡 30 分钟，使细胞均匀沉降到孔底（此步骤至关重要，请勿省略）。
5. 将 E-Plate 放入细胞培养孵育箱内的 xCELLigence 仪器中，开始自动每 15 分钟测量一次阻抗，以细胞指数（Cell Index）随时间变化的形式显示。
6. 次日，准备效应 CAR T 细胞。务必提前准备好适当的对照组（例如 Mock CAR T 细胞、非转导对照 T 细胞和/或无关 CAR T 细胞），以确保所有细胞同时准备就绪。将效应细胞和对照细胞调整至适当密度，并进行系列稀释，以确保在第 9 步向每孔加入 100 µL 效应细胞悬液时达到预期的效靶比（E:T 比）。
7. 暂停 xCELLigence 数据采集，将 E-Plate 从孵育箱转移至细胞培养罩内。
8. 从每个孔中移除 100 µL 培养基。此时每孔中残留的培养基体积为 100 µL。
9. 向各孔中加入 100 µL 系列稀释的效应 CAR T 细胞或其他对照细胞（如 Mock CAR T 细胞），以达到预期的效靶比（E:T 比）。
10. 将 E-Plate 在室温下平衡 30 分钟，使效应细胞沉降，然后将 E-Plate 放回 xCELLigence 仪器中，恢复数据采集。
11. 如需要，可在关键时间点暂停 xCELLigence 数据采集，并将板取出，以便采集少量样品用于正交检测分析（例如通过酶联免疫吸附测定（ELISA）或流式细胞术检测细胞因子产生情况）。
12. 在 EGFR-GITR-CD3 CAR T 细胞实验中，使用 ELISA 试剂盒检测干扰素-γ（IFNγ）产量（遵循制造商说明书；参见 材料表）。
    关于液体肿瘤应用的说明：在检测非贴壁性血液系统癌细胞时，需在接种细胞前先用特异性识别癌细胞表面抗原的抗体包被 E-Plate 的孔。对于 Raji B 细胞系，使用基于抗 CD40 的固定试剂（参见 材料表中的液体肿瘤杀伤检测试剂盒）。以下是包被操作步骤：
13. 用固定缓冲液将固定试剂（抗 CD40）稀释至浓度为 4 µg/mL。
14. 在组织培养罩内操作，向 E-Plate 的每个孔中加入 50 µL 稀释后的固定试剂。将 E-Plate 置于室温或 37 °C 培养箱中孵育 3 小时。
15. 移除固定试剂，并用洗涤缓冲液至少清洗 E-Plate 2 次。此时 E-Plate 即可用于接种 Raji 目标细胞（30,000 个/孔）。
16. 继续执行上述第 4.1 步，完成后续操作流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7-AAD	Biolegend	420404
抗CD40，液体肿瘤杀伤检测试剂盒	ACEA Biosciences	8100005
抗人F(ab')2	Jackson Immunoresearch laboratories.	109-116-088
APC抗CD3	Biolegend	317318
检测培养基RPMI1640	life technologies.Corp	11875-093
CAR-T细胞冻存液CryostorCS10	Stemcell technologies	#07930
ProMab提供的CAR-T细胞培养基	AIM-V+300IFU/ml IL-2	12055-091
CD3/CD28包被微珠，Dynabeads	Thermofisher	11131D
DMEM	GElifesciences.com	SH30243.02
FACS缓冲液	Promab自制
FBS	Lonza.com	14-503F
HEK293FT	Thermo Fisher	R70007
INFg ELISA试剂盒	Thermo Fisher
慢病毒包装混合液	System Biosciences	VP100
Lenti-X定量RT-PCR滴度测定试剂盒（Clontech）	Takara	631235
ProMab提供的靶细胞培养基	随细胞系而异
实时细胞分析仪	ACEA Biosciences
PCR仪	Thermo Fisher
转导增强剂，Virus Transduction Enhancer（Alstem）	Transplus, Alstem	V020
转染稀释液，Opti-MEM	Thermo Fisher
转染试剂，NanoFect试剂	Alstem	NF100