一种体外测定抗TNFα抗体抗凋亡活性的方法

摘要

来源：Tierrablanca-Sánchez, L., 等. 利用中和TNF法测定抗TNF单克隆抗体（mAb）相对效价 体外 生物分析方法 视频实验杂志 (2017)

本视频展示了一种通过评估抗肿瘤坏死因子-α（TNFα）抗体有效性的技术，TNFα是一种炎症性细胞因子 体外 生物分析方法。将TNFα引入应激细胞时，会触发细胞凋亡。然而，与抗体结合后可限制TNFα的作用，从而避免细胞凋亡。细胞凋亡程度通过生物发光检测法进行定量。

方案

1. 培养基与溶液的配制

1. 准备培养基：含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640，pH值为7.4。
2. 制备检测培养基：不含酚红的 RPMI-1640 培养基，添加 1% FBS，pH 值为 7.4。
3. 制备细胞洗涤液：不含 Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），含 0.02% EDTA，pH 7.4。
4. 制备细胞解离液：含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的0.125%胰蛋白酶。
   1. 解冻100 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并转移至无菌的500 mL烧瓶中。
   2. 加入100 mL细胞洗涤液混匀，分装至15 mL无菌离心管中，每管15 mL。于-70至-80 °C保存，直至使用。
   3. 将这些溶液经0.22 µm滤膜过滤，并在使用前至少30分钟预热至37 °C。
5. 制备凋亡诱导用储存液：TNFα 溶液，浓度为 3.3 µg/mL。
   1. 在原装容器中，将20 µg TNFα溶于500 µL经滤膜除菌的水中，混匀至完全溶解。
   2. 转移至一个15 mL无菌管中，并向该管中加入5.5 mL无镁无钙的DPBS溶液。使用涡旋混合器轻轻混匀。
   3. 将溶液分装成每份70 µL，每份加入0.5 mL微量离心管中，于-80 °C保存。
6. 制备凋亡诱导溶液：40 ng/mL 的 TNFα 溶液。
   1. 解冻一份细胞凋亡诱导储存液，在25 ˚C水浴中孵育10分钟。
   2. 在15 mL无菌离心管中，将61 µL浓度为3.3 µg/mL的TNFα溶液加入4.939 mL检测培养基中，混匀后得到终浓度为40 ng/mL的凋亡诱导工作液。
   3. 用涡旋混合器混匀10秒；该溶液必须在使用前新鲜配制。
   4. 在中和试验使用前，将溶液于37 °C预热至少30分钟。
7. 制备底物溶液：caspase 3/7 Glo 溶液。
   1. 在使用前将caspase缓冲液（caspase 3/7 Glo缓冲液）解冻12小时。
   2. 将caspase缓冲液和底物（caspase 3/7 Glo底物）分别在25 ± 5 °C下放置30分钟，然后再混合。
   3. 将10 mL caspase缓冲液转移至底物小瓶中，通过倒置混匀。
   4. 保持在25 ± 5 °C，避光保存至使用。
      注意： 该溶液在室温下可稳定保存6小时。

2. 细胞培养与计数

1. 细胞复苏与首次传代。
   1. 从-80 ˚C冰箱中取出一支WEHI 164细胞冻存管，转移至冰浴中。
   2. 用1 mL预温的培养基反复吹打，直至冻存细胞完全解冻。
   3. 在15 mL无菌离心管中加入9 mL预温的培养基。
   4. 将细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中，轻轻颠倒混匀5次。
   5. 在125 × g 条件下离心3分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀充分吹散。
   6. 向离心管中加入5 mL培养基，混匀至细胞完全重悬。
   7. 进行细胞计数时，取50 µL细胞悬液加入500 µL微量离心管中，与50 µL 0.4%台盼蓝混合。计数细胞并调整至0.5 × 10⁶ 个细胞/mL。参见下文步骤2.2。
   8. 向75 mL细胞培养瓶中加入13 mL预温的培养基。
   9. 根据步骤2.1.6所得细胞悬液的体积，加入适量细胞悬液，使培养瓶中细胞终浓度为0.5 × 10⁶ 个细胞/mL，于37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养。
2. 细胞计数。
   1. 取步骤2.1.6中的细胞悬液0.05 mL加入血细胞计数板，使用台盼蓝染色法在显微镜下测定细胞密度。
   2. 定量总细胞数和活细胞数。
   3. 将细胞悬液调整至0.5 × 10⁶ 个细胞/mL。
      V_培养基(mL) =
      V_培养基(mL) = (5mL - V_细胞悬液)
      V_培养基(mL) = 调整后的WEHI 164细胞悬液体积
      NVC = 每毫升WEHI 164活细胞数
      V_培养基(mL) = 为达到0.5 × 10⁶ 个细胞/mL而加入细胞悬液中的培养基体积
      0.5 × 10⁶ = 目标细胞密度
3. 细胞消化及第二、第三次传代。
   注意：可使用真空系统从培养瓶中移除液体。可使用一次性或玻璃无菌移液管。若移液管顶部带有棉塞，使用前必须去除。
   1. 使用1 mL无菌移液管和真空系统，移除细胞培养T型瓶中的培养基。
   2. 向T型培养瓶中加入5 mL细胞洗涤液，轻轻混匀后弃去。重复此步骤两次。
      注意：彻底去除培养基对有效细胞消化至关重要。
   3. 向T型瓶中加入15 mL细胞消化液，在37 °C、5% CO₂ 培养箱中静置3分钟。
   4. 在显微镜下确认瓶壁内无贴壁细胞残留。使用20 mL无菌移液管将细胞从T型瓶中转移至50 mL无菌离心管中。
   5. 在125 × g 条件下离心3分钟。弃去上清液，用5 mL新鲜培养基重悬细胞沉淀。
   6. 计数细胞，并根据公式1加入适量培养基，使细胞浓度达到所需值。
   7. 将细胞悬液加入72 cm² T型培养瓶中，于37 °C、5% CO₂ 条件下过夜培养。
   8. 在进行中和实验前，至少传代两次。在接下来的两天中重复步骤2.3.1–2.3.8。
4. 实验用细胞悬液制备。
   1. 选择已传代至少三次的WEHI 164细胞。参见步骤2.1。
   2. 按照本实验方案中的步骤2.2和2.3进行细胞消化与计数。
   3. 根据公式1将细胞悬液稀释至0.5 × 10⁶ 个细胞/mL。
   4. 将此细胞悬液用于中和实验。使用前需用涡旋振荡器充分混匀所有细胞悬液。

3. 抗体准备与稀释

1. 单克隆抗体的定量。
   1. 使用其质量消光系数（1.39），通过280 nm处的紫外吸收测定参考物质、对照样品和分析样品的浓度。
      注意：原始浓度可取自药品标签，但必须通过紫外吸收进行验证。
2. 单克隆抗体稀释。
   1. 将所有样品独立地在2 mL微量离心管中用不含Mg²⁺和Ca²⁺的DPBS溶液稀释，制备成三份平行样，稀释至2 mg/mL。使用不含Mg²⁺和Ca²⁺的DPBS溶液作为空白对照，通过紫外吸收法三复孔测定确认该浓度。
   2. 使用涡旋混合器将储备蛋白溶液混合5秒。
   3. 将每种2 mg/mL的单克隆抗体溶液取100 µL，加入0.9 mL检测用培养基中进行稀释。
   4. 使用涡旋混合器混合5秒。
      注意：这些溶液的浓度为200 µg/mL。每个三复孔均需单独进行稀释。
   5. 取10 µL每种200 µg/mL的单克隆抗体溶液，加入0.99 mL检测用培养基中稀释。使用涡旋混合器混合5秒。这些溶液的浓度为2 µg/mL。在用于中和实验前，对每个三复孔进行系列稀释。
   6. 在三个独立的微孔板中制备抗TNFα单克隆抗体的稀释液。将每个独立三复孔取两份复孔，分装至同一微孔板中，如表1所示。参考物质
   7. 按照表2所示，对每种参考品、样品或对照品进行单克隆抗体稀释。
      注意：本表中描述的抗TNFα单克隆抗体浓度并非中和实验中的最终浓度。
   8. 将微孔板保存在25 ± 5 °C条件下，直至使用。

4. 使用 WEHI 164 细胞进行中和实验

1. 在本方案的任何步骤加样前，通过涡旋振荡充分混匀所有细胞悬液（0.5 × 10⁶ cells/mL）。
   注意： 在本节中，所有溶液在使用前需在37 °C预热30分钟。
2. 将50 µL细胞悬液分别加入微孔板的60个孔中，从第2列至第11列、B行至G行依次加样。
3. 将50 µL的单克隆抗体（mAb）参考品、样品和对照品稀释液加入微孔板中。加样模式请参照图1所示。
4. 向每个孔中加入50 µL凋亡诱导溶液。
5. 使用细胞对照：将50 µL WEHI 164细胞加入三个孔中，并用检测培养基补足每孔至终体积150 µL。
6. 使用细胞毒性对照：将50 µL WEHI 164细胞与50 µL凋亡诱导溶液混合后加入孔中，并用检测培养基补足每孔至终体积150 µL。
7. 对于TNFα对照，使用50 µL凋亡诱导溶液，并用检测培养基补足至150 µL。
8. 空白对照孔仅加入150 µL检测培养基。
9. 其余孔中各加入150 µL培养基，以避免微孔板在孵育过程中发生蒸发效应。
10. 在另外两个微孔板中重复步骤4.1.1–4.1.9两次。
    注意： 微孔板中单克隆抗体（mAb）的终浓度分别为：0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014和0.004 µg/mL。
11. 按照图1所示，将样品加入微孔板中。
12. 将三块微孔板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育16 ± 2小时。
13. 使用前将Caspase 3/7 Glo试剂在25 ± 5 °C下静置30分钟。
14. 向所有孔（包括样品孔和对照孔）中加入100 µL该试剂。
15. 加样后立即在25 ± 5 °C下使用微孔板涡旋振荡器振荡3分钟。
16. 将微孔板在25 ± 5 °C避光孵育2.5 ± 0.5小时。
17. 将微孔板插入化学发光仪中，并进入下一节操作。

5. 结果分析

1. 使用发光检测软件，选择发光模式和终点检测功能。
2. 选择一个96孔透明底板，并选择其内部80个孔，排除第1列和第12列。
3. 设定积分时间为1,250毫秒，并在读数前对微孔板进行10秒的振荡混匀。
4. 选择参考物质、待测物质和对照样品所放置的孔位，并标注其相应的浓度。
5. 使用发光仪读取微孔板中放置的样品。
6. 采用四参数方程分析结果，绘制剂量-反应曲线，如图2所示。
   注意：在四参数方程中，C代表50%有效浓度（EC50）。该值将用于通过效应函数比较参考物质、待测样品和对照样品。
7. 计算相对效价时，将参考物质设定为100%，相应计算样品和对照的效价。
   注意：这些数值如图3所示。

表1：微孔板样品阵列。 完整的中和实验必须在三个微孔板中进行，坐标范围为B2至G11。参考样品、待测样品和对照样品的随机分配可使研究人员验证实验中是否存在任何偏差。

平板 1		平板 2		平板 3
孔位	样品	孔位	样品	孔位	样品
B2:B11	参比物质	B2:B11	对照样品	B2:B11	待测样品
C2:C11		C2:C11		C2:C11
D2:D11	待测样品	D2:D11	参比物质	D2:D11	对照样品
E2:E11		E2:E11		E2:E11
F2:F11	对照样品	F2:F11	待测样品	F2:F11	参比物质
G2:G11		G2:G11		G2:G11

表2：抗TNFα单克隆抗体稀释方案。 本表展示了抗TNFα单克隆抗体的系列稀释。表中所述终浓度并非检测体系中的实际浓度，因为在检测体系中，抗TNFα单克隆抗体被进一步稀释了3倍（单抗稀释液 + 培养基 + 细胞悬液）。加粗行表示来自第3、5、7、9和10行的稀释；非加粗行表示来自第3、4和6行的稀释。这些系列稀释应在进行中和实验前立即完成。分装稀释液前，必须用移液器上下吹打混匀三次。

孔板列	检测培养基体积 (μL)	参考物质、分析样品或对照样品体积 (μL)	孔板中的浓度 (ng/mL)
2	0	230	2000
3	150	来自第2行的150	1000
4	75	来自第3行的75	500
5	100	来自第3行的50	333
6	75	来自第4行的75	250
7	75	来自第5行的75	166
8	75	来自第6行的75	125
9	75	来自第7行的75	83
10	75	来自第9行的75	41
11	150	来自第10行的75	13

结果

图 1：检测板中样品的分布。 B1 至 G11 为微孔板中的孔位坐标，表示样品稀释液所放置的位置。缺失的坐标位置为装有对照和检测培养基的孔（A1-A12 和 H1-H12）。这种样品在微孔板中的随机分布（正向与反向稀释）有助于消除因培养基蒸发或其他变量引起的实验结果偏差。建议每块微孔板由同一名分析人员一次性完成。R：参考品，S：样品，CS：对照样品，Dil：稀释。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
WEHI 164	ATCC	CRL-1751	小鼠（Mus musculus）纤维肉瘤细胞
RPMI-1640 培养基	ATCC	30-2001	将培养基储存于 2 °C 至 8 °C
RPMI 1640 培养基，无酚红	GIBCO	11835-030	将培养基储存于 2 °C 至 8 °C
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	GIBCO	25200-056	将试剂储存于 -10 °C 至 -20 °C
不含钙、镁的 DPBS	GIBCO	14190-136	将培养基储存于 2 °C 至 8 °C
重组人 TNF-α 蛋白	R&D Systems	210-TA-020	储存于 -20 °C 至 -70 °C
胎牛血清（美国来源），超低 IgG	HyClone	SH3089803	储存于 -10 °C 至 -20 °C
胎牛血清（美国来源），经鉴定	HyClone	SH3007103	储存于 -10 °C 至 -20 °C
Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒	Promega	G8093	Caspase-Glo 3/7 底物和 Caspase-Glo 3/7 缓冲液需避光保存于 –20 ºC
EDTA 二钠盐，二水合物，晶体，ACS 级试剂	J.T.Baker	8993-01	--
待测单克隆抗体 阿达木单抗	Probiomed	NA	微孔板中的终浓度为：0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014 和 0.004 μg/mL
参比与对照单克隆抗体 阿达木单抗	Abbvie	NA	微孔板中的终浓度为：0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014 和 0.004 μg/mL
微孔板读板仪	Molecular Devices	89429-536	SpectraMax M3 多功能读板仪
微孔板读板仪软件	Molecular Devices	--	SoftMax Pro 6.3 GxP
培养箱	Revco	30482	Revco RNW3000TABB 强制通风 CO2 培养箱
层流洁净工作台	The Baker Company	200256	Baker SG603A-HE | 高效，II 级 A2 型