基于疫苗脉冲树突状细胞的体外诱导淋巴细胞增殖实验方法

摘要

来源：Liaqat, F.，等，利用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性。J. Vis. Exp. (195)，(2023)。

本视频展示了一种基于单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）的检测方法，用于评估市售疫苗的免疫原性。MoDC 检测可用于研究树突状细胞对抗原、病原体或治疗手段的反应，有助于深入了解免疫应答机制、疫苗研发以及免疫治疗研究。

方案

1. 初始 MoDCs 的制备

注意： 通过颈静脉穿刺，使用含肝素的真空采血管（本研究共使用八支9 mL血液管）从一只无特定病原体的犊牛采集全血样本。将血液置于冰盒中运输。样本可于2-4 °C保存以备后续使用，或立即进行处理。保持血液持续旋转，防止血液凝固。使用70%乙醇对真空采血管进行灭菌。以下所有实验均使用一个生物学样本和六个技术重复进行。

1. 采用密度梯度离心法从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞（PBMC）
   1. 通过反复倒置10次，充分混匀血液。
   2. 使用10 mL移液器将20 mL肝素抗凝血转移至无菌50 mL离心管中，并加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）进行稀释。
   3. 向另一无菌50 mL离心管中加入15 mL淋巴细胞分离液。
      注意：移取前应使淋巴细胞分离液恢复至室温。
   4. 将装有淋巴细胞分离液的50 mL离心管倾斜至45°角。将25 mL移液器的吸头垂直对准液面，小心地将30 mL血液-PBS混合液缓慢铺加在淋巴细胞分离液上方，避免两层液体混合。随后极缓慢地将离心管恢复至垂直位置。
   5. 在20 °C条件下以800 × g离心35分钟，加速度设为最大，不启用刹车（即关闭减速功能）。
   6. 使用巴斯德移液管收集PBMC层（位于血浆层下方的薄白色层），并将其转移至新的50 mL离心管中。
      注意：密度梯度离心可将全血分离为不同层次：红细胞沉降到底部形成沉淀，单个核细胞（PBMCs）位于界面层，血浆位于最上层。粒细胞则位于沉淀与PBMC层之间。
   7. 加入PBS至总体积达40 mL，充分上下吹打混匀，对收集的PBMC进行两次洗涤。然后在4 °C条件下以500 × g离心7分钟，加速度和减速度均设为最大。
   8. 倾去上清液，将沉淀重悬于15 mL 1×氯化铵-氯化钾（ACK）缓冲液中，在室温下孵育10–15分钟。
      注意：孵育时间不得超过15分钟。商用ACK缓冲液用于裂解PBMC组分中残留的红细胞（RBCs）。
   9. 加入PBS至总体积达40 mL，然后在4 °C条件下以500 × g离心7分钟，加速度和减速度均设为最大。
   10. 倾去上清液，并重复步骤1.1.9。
   11. 弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL完全培养基（室温）中。
       注意：完全培养基由RPMI 1640基础培养基添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素组成。
2. 利用CD14偶联磁珠从PBMC群体中进行CD14^+/−细胞的磁性分离
   1. 取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝（0.4%）溶液混合，使用洁净的血细胞计数板进行细胞计数。
      ​注意：台盼蓝是一种有毒化学物质，具有潜在致癌性。操作时应佩戴个人防护装备（PPE）以避免接触，废弃物应置于密封的专用有毒废物容器中。在显微镜下观察时，死细胞呈蓝色，活细胞则呈透明状。
   2. 在500 × g条件下离心7分钟。
   3. 用移液器吸弃上清液，按每1 × 10⁷个细胞加入40 µL荧光激活细胞分选缓冲液（FACS缓冲液）重悬沉淀，并用移液器充分混匀。
      注意：FACS缓冲液由含2% FBS和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS溶液配制而成。
   4. 每1 × 10⁷个细胞加入5 µL CD14微珠缓冲液，并用移液器充分混匀。
   5. 在4–8 °C条件下孵育30分钟，以实现牛源CD14⁺单核细胞的阳性筛选。孵育期间每15分钟涡旋振荡一次。
   6. 可选步骤（用于流式细胞术分析）：加入10 µL CD14-FITC（异硫氰酸荧光素）标记抗体，随后在4–8 °C条件下继续孵育15分钟。详见步骤5中的流式细胞术分析说明。
   7. 加入1 mL FACS缓冲液，在500 × g条件下离心7分钟。
   8. 弃去上清液，按每1 × 10⁸个细胞加入500 µL FACS缓冲液重悬沉淀。
   9. 将免疫磁性细胞分离柱插入磁力架（磁柱支架）中，并在柱出口下方放置一个15 mL收集管，用于收集穿流液。
   10. 用1 mL脱气FACS缓冲液冲洗分离柱。冲洗后，更换新的15 mL收集管。
   11. 将步骤1.2.8所得细胞悬液分次加入分离柱，每次加入500 µL缓冲液中含有1 × 10⁸个细胞，通过移液器使其自然流过柱体。
       注意：在将细胞加入分离柱前混匀时，应注意避免产生气泡。
   12. 每次用3 mL脱气FACS缓冲液冲洗分离柱，重复3次。
   13. 收集穿流液，并将此第一洗脱组分标记为CD14⁻细胞组分（即去除CD14⁺单核细胞后的PBMCs），也称为初始淋巴细胞组分。
       注意：CD14⁻细胞需维持在完全培养基中，直至抗原刺激的MoDCs制备完成。
   14. 将分离柱从磁力架上取下。
   15. 在分离柱下方放置一个新的无菌15 mL离心管，用于收集洗脱液。
   16. 向分离柱中加入5 mL FACS缓冲液，并立即使用推杆将其快速推出。
   17. 收集洗脱液，并将此第二洗脱组分标记为CD14⁺细胞组分；该组分也称为初始单核细胞组分。
   18. 向收集的CD14⁺单核细胞中加入完全培养基，调整至终浓度为1 × 10⁶个细胞/mL。
       注意：需对洗脱所得CD14⁺细胞组分中的活细胞进行计数，以估算达到目标细胞浓度所需的完全培养基体积。
   19. 取一无菌24孔板，向每孔加入1 mL细胞悬液（1 × 10⁶个细胞/mL）。
3. 通过添加3% w/v细胞因子混合物（GM-CSF + IL-4）诱导CD14⁺初始单核细胞向初始MoDCs分化，共孵育5天
   1. 向每孔含CD14⁺单核细胞的培养孔中补充40 µL（3% w/v）试剂盒提供的细胞因子混合物。
   2. 将培养板置于含5% CO₂、37 °C的湿润培养箱中孵育48小时。
   3. 第2天，用移液器将每孔一半内容物（500 µL）转移至各自的1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以500 × g离心7分钟。
   4. 弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL新鲜完全培养基中。
   5. 将步骤1.3.4所得细胞悬液中的500 µL重新转移回对应孔中，使每孔终体积恢复至1 mL。
   6. 向每孔补充20 µL细胞因子混合物。
   7. 将细胞继续在含5% CO₂、37 °C的湿润培养箱中孵育72小时。
   8. 第5天孵育结束后，从培养箱中取出培养板。
      注意：此时每孔含有1 mL初始MoDCs细胞悬液。MoDCs数量约为最初接种单核细胞数（1 × 10⁶/mL）的一定比例（约20%）。

2. 抗原脉冲MoDCs的制备

注意：一种可商购且已获临床批准的狂犬病病毒（RV）疫苗可诱导初始MoDC分化为成熟的抗原呈递型MoDC。使用单剂RV疫苗的0.1%（约1 µL）来制备抗原刺激的MoDC。此外，建议在生成初始MoDC的同一培养板中制备RV刺激的MoDC，因为将初始MoDC转移至新的24孔板会对细胞产生不利影响。

1. 在24孔板中，向1 mL未刺激的MoDC培养物中加入1 µL/mL的RV悬液，在5% CO₂、37 °C条件下孵育48小时。
   注意：未接受RV刺激的未刺激MoDC用作背景对照（在后续步骤中与淋巴细胞共培养时也作为非特异性刺激对照）。
2. 孵育后，在第7天将含有抗原脉冲MoDC的24孔板置于冰上10分钟。
3. 每孔加入1 mL预冷的PBS，通过移液充分混匀各孔，然后将悬液转移至15 mL离心管中。
4. 用2 mL预冷的PBS洗涤各孔，以收集残留于孔内的细胞。
5. 将洗涤液转移至相应离心管中，于500 × g 离心7分钟。
6. 弃去上清液，将细胞沉淀（抗原脉冲MoDC）重悬于完全培养基中，并调整体积使终浓度为1 × 10⁵ 个细胞/mL。
   注意：计数活细胞以估算达到目标细胞数量所需的培养基体积。使用第7天的RV脉冲MoDC进行MoDC-淋巴细胞共培养体系。

3. MoDC-淋巴细胞共培养

注意：体外 MoDC-淋巴细胞共培养系统用于评估MoDCs激活抗原特异性淋巴细胞的能力。经过16天共培养后，细胞分为不同处理组，包括特异性组、非特异性组和对照组。特异性组定义为与RV脉冲MoDCs共培养的淋巴细胞；非特异性组定义为与非抗原脉冲MoDCs共培养的淋巴细胞；对照组定义为不与MoDCs共培养的淋巴细胞。

1. 将完全培养基加入洗脱的初始淋巴细胞组分（CD14阴性）中⁻ 细胞）以获得 2 的细胞浓度 × 10⁶ 细胞/mL
   注意：计数CD14阳性活细胞⁻ 自收集以来已在24孔板中使用完全培养基进行培养的细胞，以估算达到目标细胞数量所需的培养基体积。
2. 第7天，取一个无菌的24孔板，每孔接种1 mL初始淋巴细胞悬液（2 × 10⁶ 细胞/mL）加上1 mL抗原脉冲或非抗原脉冲MoDC悬液（1 × 10⁵ 细胞/毫升
   注意： 每孔总体积为 2 mL，MoDCs 与淋巴细胞的比例为 1:20。
3. 将培养板在37℃孵育48小时 °C 和 5% CO₂.
4. 使用抗原脉冲的MoDC进行培养扩增和再刺激
   1. 抗原脉冲MoDC-淋巴细胞共培养孵育至第9天后，每孔补充20 ng/mL重组IL-2，继续孵育120小时（即5天）。
   2. 第14天，将1 mL共培养物转移至无菌的1.5 mL离心管中，在500 × g条件下离心 × g 7 分钟
   3. 弃去上清液，用1 mL抗原脉冲或非脉冲MoDCs重悬细胞沉淀（1 × 10⁵ 细胞/mL）。用移液器轻轻混匀，并将细胞悬液转移回指定的孔中。
      注意： 此步骤中，每个孔中的总体积为 2 mL。
   4. 继续在5% CO₂条件下孵育₂ 和 37 ˚在37°C下孵育48小时。第16天孵育结束后，共培养体系即可用于流式细胞术、qPCR和ELISA分析。
      注意： 每2 mL MoDC-淋巴细胞共培养体系中，取1 mL重悬细胞用于流式细胞术染色，1 mL用于RNA提取，两者的上清液用于ELISA检测。

4. 流式细胞术分析

注意：在将样本上机进行流式细胞术检测之前，需使用适当的标记物/单克隆抗体对细胞进行染色。有关流式细胞术分析所用试剂（染色单克隆抗体及同型对照）、试剂盒、仪器和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 流式细胞仪染色方案
   注意：使用抗CD14单克隆抗体（mAb）对PBMCs、初始淋巴细胞和单核细胞进行细胞表面染色（步骤1.2.6）。对初始MoDCs的细胞表面染色，使用特异性抗CD86、抗CD40和抗MHC II的单克隆抗体。对第16天共培养细胞的细胞表面染色，使用抗CD4、抗CD8和抗CD25单克隆抗体；对于胞内染色，使用抗Ki-67单克隆抗体。此外，使用阴性同型对照单克隆抗体或不加单克隆抗体（FMO：荧光减一）对细胞进行染色。表面标记物与胞内标记物染色的主要区别在于：对于表面标记物，细胞必须在活/死（L/D）染色或其他任何处理之前，先用特异性表面单克隆抗体染色。而胞内染色则在L/D染色之后进行，并需要固定和透化步骤，以允许抗体进入细胞内部。
   1. 用移液器将1 mL细胞悬液转移至无菌的1.5 mL离心管中，于500 × g离心10分钟。
      ​注意：离心后，在处理MoDC-淋巴细胞共培养细胞时，保留上清液用于ELISA分析。
   2. 用1 mL PBS重悬沉淀，并转移至15 mL离心管中。用另外1 mL PBS收集残留细胞，并与重悬的沉淀合并。
   3. 向含细胞的15 mL离心管中加入10 mL PBS，用移液器吹打混匀，于850 × g离心7分钟。
   4. 弃去上清液，重复步骤4.1.3。
   5. 弃去上清液，小心地用倾倒后残留的液体（约180 µL）重悬细胞沉淀。
   6. 将细胞悬液转移至V型底96孔板中，并密封各孔以防止溢出。
   7. 将板在1,400 × g下离心5分钟。离心后，将板快速翻转至废液容器上方以排空孔内液体，并轻拍板于吸水纸上，确保去除多余液体。
   8. 每孔加入25 µL表面染色主混合液，用移液器轻轻混匀，随后在4 ˚C避光孵育30分钟。
      注意：为单个孔配制表面染色主混合液时，将2.5 µL表面单克隆抗体加入20 µL FACS缓冲液中。
   9. 每孔加入200 µL FACS缓冲液，于1,400 × g离心5分钟。离心后，通过倾倒弃去孔内液体，并轻拍板于吸水纸上以去除过量液体。
   10. 每孔加入100 µL L/D染色溶液。用移液器充分混匀，随后在4 ˚C避光孵育15分钟。
       注意：为单个孔配制L/D染色液时，将0.25 µL L/D染料溶解于100 µL FACS缓冲液中。L/D染料有助于区分活细胞与死细胞。
   11. 每孔加入100 µL FACS缓冲液。盖上盖子，将板于1,400 × g离心5分钟。通过倾倒弃去上清液，并轻拍板于吸水纸上。
   12. 重复步骤4.1.11。
   13. 每孔加入50 µL固定液（试剂盒提供），用移液器混匀，随后在室温避光孵育10分钟。
   14. 每孔加入150 µL试剂盒提供的1x透化-洗涤缓冲液（PW），并盖上盖子。
       注意：配制10 mL 1x PW缓冲液时，将1 mL 10x透化缓冲液稀释于10 mL dH₂O中。
   15. 将板于4 ˚C、1,400 × g离心5分钟。通过倾倒弃去上清液，并轻拍板于吸水纸上。
   16. 每孔加入200 µL 1x PW缓冲液，随后于4 ˚C、1,400 × g离心5分钟。通过倾倒弃去上清液，并轻拍板于吸水纸上。
   17. 进行胞内染色时，每孔加入25 µL胞内染色主混合液（抗人Ki-67单克隆抗体）。充分混匀后，将板在4 ˚C或冰上避光孵育30分钟。
       注意：为单个孔配制胞内染色主混合液时，将1 µL Ki-67单克隆抗体加入24 µL 1x PW缓冲液中。胞内染色标记物仅在处理第16天共培养细胞时使用。在处理PBMCs、初始淋巴细胞、单核细胞和初始MoDCs时，不进行胞内染色。
   18. 孵育结束后，每孔加入200 µL 1x PW缓冲液。用移液器混匀后，于1,400 × g离心5分钟。通过倾倒弃去上清液，并轻拍板于吸水纸上。
   19. 每孔加入200 µL FACS缓冲液，随后于1,400 × g离心5分钟。通过倾倒弃去上清液，并轻拍板于吸水纸上。
   20. 用200 µL FACS缓冲液重悬细胞沉淀，并将每孔内容物转移至独立的无菌流式细胞仪检测管中。每孔使用300 µL FACS缓冲液收集残留细胞。细胞现已准备好进行流式细胞术分析。
2. 在流式细胞仪上运行样本
   注意：根据仪器制造商的操作手册，在流式细胞仪（使用488 nm、638 nm和405 nm激光器）上运行样本。有关详细信息、故障排除和方案定制，请参阅操作手册。
   1. 在读取样本前后执行常规清洗程序。
      注意：将试管装入仪器时，不得跳过位置。
      1. 清洗循环使用总共四支试管，第一支试管中加入流式清洗试剂，其余三支试管中加入dH₂O；每支试管均加入3 mL。在清洗运行过程中，以中等流速采集数据约1分钟，每管捕获100,000个事件，前向散射（FSC）电压设为330 V，侧向散射（SSC）电压设为265 V。
         注意：清洗过程中不应报告任何碎片或细胞事件；若出现此类情况，需重复清洗步骤。在运行样本前，确保所有样本均为均匀悬液，以保证读数准确。
   2. 连接并启动细胞仪时，点击标题栏左上角的应用程序按钮。在应用程序下拉菜单中选择细胞术选项，然后点击开机。
      注意：在应用程序下拉菜单中，打开选项允许用户浏览预设的检测程序，而新建方案选项允许用户创建新方案。
   3. 首先将阴性对照样本装入多管架中。选择新建方案，并在工作区/屏幕左侧观察工作列表。
   4. 在工作列表中，定义样本在多管架中的位置，并为样本和方案命名以便识别。
   5. 在工作区左侧的硬件面板中，调整并选择多个参数，包括检测器（FSC、SSC和10个荧光通道）、光电倍增管的电压（V）和增益，以及信号的面积-高度-宽度（AHW）。
      注意：以下检测器设置基于实验和所用仪器选定：FSC-AHW：AHW，V：270，G：5；SSC-AHW：A，V：350，G：10；FL1（CD8/FITC葡聚糖）-AHW：A，V：400，G：1；FL2（CD25/PE）-AHW：A，V：500，G：1；FL6（CD4/Alexa Fluor 647）-AHW：A，V：700，G：1；FL7（Ki-67/Alexa Fluor 700）-AHW：A，V：625，G：1；FL9（L/D）-AHW：A，V：425，G：1。
   6. 在标题栏下方的仪器-采集控制面板中，调整所需的流速（中等）、时间（5分钟）和事件数（见步骤5.2.8）。点击单次采集选项，使仪器吸取/运行样本并显示检测事件的实时预览。
   7. 根据实时预览，调整荧光阈值（电压和增益）和细胞大小，最终围绕目标细胞群绘制门控，同时排除任何细胞碎片。
      注意：FSC可根据细胞大小区分细胞，从而帮助用户区分免疫系统中的不同细胞类型，如单核细胞和淋巴细胞；单核细胞体积较大，其FSC信号强度高于淋巴细胞。
   8. 采集约总计5,000个活MoDCs、50,000个活淋巴细胞和50,000个活单核细胞事件。
   9. 当所有参数均以阴性对照样本为参考调整完毕后，点击停止，并保存方案。
   10. 现在将所有样本装入多管架中。在工作列表中定义每个样本，并将基于阴性对照调整的参数应用于实验中的所有样本。点击采集选项，使实验中所有样本连续运行。
   11. 当所有样本的数据采集完成后，使用适当的数据分析软件保存并转换为可读数据，该软件应能生成连续的双参数和单参数直方图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ACK 裂解缓冲液	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	用于裂解收获的 PBMC 组分中残留红细胞的氯化铵-氯化钾缓冲液
牛树突状细胞生长试剂盒	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	由重组牛 IL-4 和 GM-CSF 组成的细胞因子混合物
牛 IFN-γ ELISA 试剂盒	Bio-Rad	MCA5638KZZ	用于检测培养上清液中 IFN-γ 表达水平的试剂盒
Nobivac 狂犬病疫苗	MSD Animal Health, UK		含>2 I.U./mL 狂犬病毒株的灭活疫苗，使用浓度为 1 µL/mL 细胞培养物
光学封膜	Bi0-Rad	TCS0803	0.2 mL 平底 PCR 管 8联管盖条，光学透明，超清晰，适用于 qPCR 仪器
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4，1× 浓度
流式管 / FACS（荧光激活单细胞分选）管	Falcon Corning	352235	5 mL，无菌，圆底聚苯乙烯试管，带滤网 snap cap，用于流式细胞术分析
人 CD14 微磁珠	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	2 mL 与单克隆抗人 CD14 抗体（IgG2a 同种型）偶联的微磁珠，用于从 PBMC 中分离牛单核细胞
纯化抗人 Ki-67 抗体	Biolegend, USA	350501	单克隆抗体，与牛交叉反应，克隆号 ki-67
RPMI 1640 培养基	Sigma Aldrich	R8758	含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的细胞培养基
组织培养测试板 24 孔	TPP, Switzerland	92024	24 孔板，经辐射灭菌，表面促生长处理，容积 3.18 mL