一种用于评估血细胞重新黏附至造血囊的血细胞干扰检测法

摘要

来源：Petraki, S. 等，黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫血细胞群体的检测方法。视觉化实验杂志（2015）

本视频展示了血细胞紊乱检测，用于评估血细胞的重新黏附能力 果蝇 幼虫的造血囊。机械扰动可释放其中的驻留血细胞，导致循环血细胞数量升高。恢复后，驻留血细胞重新黏附，表明该过程具有可逆性。

方案

1. 血细胞采集体外检测法

1. 载玻片的制备：
   1. 显微镜无拼图扫描功能时的选项1：针对每只待分析的幼虫，准备一张载玻片，用Pap笔绘制约5个直径2 mm的圆形小室，每个小室对应显微镜的视野区域；向每个小室中加入约5–10 µl S2培养基图1A将载玻片置于湿盒中，以防止孔内液体干燥。
   2. 选项2，适用于具有拼接扫描功能的显微镜：针对每条待分析的幼虫，准备一张载玻片，其上用Pap笔绘制3至4个直径约3–4 mm的圆形凹槽；每个凹槽中加入约15–20 µl的S2培养基（图1B将载玻片置于湿盒中，以防止孔内液体干燥。
      注意： 上述推荐的孔数足以用于每只幼虫最多3,000个血细胞（晚期）的总量^nd 三龄幼虫，体长约2.5 - 3 mm，转基因标记了大部分幼虫血细胞。在评估较大量的血细胞时，可能需要使用更多孔以避免过度拥挤。
2. 幼虫采集：
   1. 将水喷入含有幼虫的果蝇小瓶中，冲洗幼虫至培养皿内；或舀取部分带幼虫的培养基至培养皿中，再用喷瓶加水稀释。
   2. 使用画笔轻轻将幼虫从培养皿中挑出，放入凹面载玻片或载玻片上的冷台上，置于水中。
      注意： 幼虫可在水中或冷块上短暂保存；应在45分钟或更短时间内使用标本，以避免幼虫死亡或对血细胞产生不良影响。
3. 解剖：
   1. 在冷金属板上使用荧光显微镜挑选幼虫。根据需要测量幼虫大小并进行成像。
   2. 循环血细胞的分离（“放血”）：
      1. 选定幼虫后，将一只幼虫放入第一个Pap-pen孔槽中（图1C，2A).
      2. 使用两把干净的针头或解剖剪以及镊子，在幼虫的后端和前端各做一个切口。为避免干扰体内的常驻血细胞，最好在幼虫腹侧进行这些切口。为获得一致的结果，每次实验应在每只幼虫相同的位置进行切口。对于1^st 龄幼虫，1 次切口（位于腹面前部）已足够。
      3. 让幼虫在无任何压力或物理扰动的情况下流血数秒钟图2A).
         注意： 若同时处理多个幼虫，建议先为所有幼虫完成切口操作，再进入下一步，以避免幼虫在冰上放置时间过长而影响样本完整性。
      4. 用镊子或针轻轻提起幼虫，浸入第二个孔中，以冲洗残留的循环血细胞。随后，进行驻留血细胞的释放。
   3. 组织驻留血细胞的分离（“刮取法”）：
      1. 轻轻地将幼虫转移到下一个孔中（图2C).
      2. 确定幼虫的淋巴腺，其通常位于幼虫前端约1/3处，可能通过幼虫体壁在背侧发出荧光。用针固定幼虫时，应尽可能靠近淋巴腺但避免刺穿该结构，以保护其中的驻留血细胞图 2C).
         注意： 在正常发育过程中，淋巴腺血细胞的成熟相较于幼虫血细胞有所延迟，且分化血细胞的荧光报告基因在幼龄幼虫的淋巴腺中可能不显示信号。在此情况下，无需过多关注淋巴腺，因为不会发生淋巴腺血细胞对分化荧光标记幼虫血细胞的污染。
      3. 在解剖过程中通过刮擦和/或穿刺释放体内的血细胞。使用一根针尖将幼虫靠近淋巴腺（见上文）或其他所需部位有效固定。用另一根针穿刺透过幼虫体壁可见的血细胞簇。图2C、E)，旨在分离血细胞。也可通过刮擦的方式释放血细胞。然而，过早撕裂表皮可能会释放出较大的血细胞团块，这可能增加自动计数的难度。
         注意： 根据幼虫的年龄和基因型，总血细胞数量会有所不同。为避免某些孔中血细胞过于密集而影响单细胞图像分析，应将上述释放过程分至多个孔中进行。
      4. 如果最终的尸体中仅存少量血细胞，可通过显微镜观察并使用手动计数器对这些血细胞进行计数图2E）。为便于计数，将尸体置于同一载玻片的洁净区域，并尽可能铺展至最薄，以减少光学层面的数量。
      5. 解剖完成后，等待5至10分钟，使细胞沉降（但不一定贴壁），然后对孔板进行成像。将载玻片置于湿盒中孵育，以防干燥，并避免粗暴操作载玻片，以免扰动已沉降的血细胞。
         注意： 在测定血细胞数量时，释放的细胞不应固定，且必须在解剖后尽快进行成像，最好在从幼虫释放后30分钟内完成。根据培养基体积和细胞特性，绝大多数细胞会在5至10分钟内沉降，可通过聚焦观察孔内培养基的不同光学层面来确认沉降情况。然而，此时仅有部分血细胞会黏附于载玻片表面，若对该方案进行修改以适用于基于细胞固定的实验方法，需考虑这一因素。
4. 定量分析：
   1. 在荧光显微镜下拍摄已贴壁的血细胞图像（图 2B、D、F随后使用 ImageJ 软件对血细胞进行定量分析。
   2. 为 ImageJ 细胞计数算法准备图像：
      1. 使用 ImageJ 打开孔板图像：文件 → 打开 →（找到文件并选择）。
      2. 确保图像为8位或16位。通过选择调整图像的阈值 图像 然后点击 调节 并选择 阈值. 观察“阈值窗口" (图3A).
      3. 检查“暗背景“ 选项。选择“红色并增加 较低阈值水平 （见黑色箭头），直至图像中的每个细胞均被标记为红色圆点（未被覆盖的细胞将以灰度显示）； 图3B）。随着 下限阈值 会有所增加，部分细胞将失去标记。这可作为设定距离的参考指标 较低阈值.
         注意： 偶尔细胞团无法完全分散，颗粒计数器会将其计为一个单位。在此情况下，可通过观察图像（必要时放大）并使用计数器进行手动计数，以估算细胞团中的细胞数量。或者，可 较低阈值 可通过增加分辨率来区分细胞簇；随后可使用计数器对由此产生的任何未标记细胞进行计数。
   3. 使用 ImageJ 分析细胞数量：
      1. 启动粒子分析仪以计数细胞（图3C）。选择 分析 并点击 分析颗粒 可选地选择“叠加轮廓以查看算法计数的颗粒图3D）。或者，设置单个单位的尺寸或像素面积的上限例如， 细胞，细胞团 等等。）供算法进行计数。
      2. 点击 好的. 观察一个包含计数的摘要窗口（图3E).

2. 血细胞干扰实验

1. 为扰动血细胞，选取幼虫并将其放入含有约 0.5 g 玻璃珠（212 - 600 µm）的 2 ml 微离心管中，加入 0.5 ml 水。
2. 用手以速度 10 涡旋震荡该管 1 分钟。
3. 将微离心管中的内容物倾倒至培养皿中，用画笔挑出幼虫，从而从玻璃珠中回收幼虫。
4. 恢复阶段，将幼虫置于预先准备好的含有少量果蝇食物的培养皿中。让幼虫恢复其血细胞分布模式，持续 45 分钟或按需更长时间。
   注意：丢弃任何已停止活动的幼虫，因其已在过程中死亡。然而，通常在涡旋震荡 1 分钟后我们观察到的损伤较小。
5. 恢复期结束后，继续按照上文第 1 节所述进行出血/刮取实验。

结果

图 1. 血细胞取血/刮取与扰动实验的装置示意图。（A） 单幅图像载玻片设置：使用 5X 物镜成像的五个 2 mm 方格。（B） 拼接扫描载玻片设置：使用拼接扫描显微镜对长度 ≤2.5 mm 的幼虫进行取血/刮取成像，共四个 3 mm 方格。推荐成像物镜为 5X 或 10X。（C） 取血/刮取实验示意图及使用 ImageJ 进行定量分析的结果。（D） 在扰动实验中，通过涡旋混合幼虫与玻璃珠机械性破坏血细胞分布模式。随后让幼虫恢复 45 分钟，期间血细胞重新黏附至造血 pockets（Hematopoietic Pockets）。该方法可用于评估血细胞的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 cm/9 cm 培养皿			每种待评估基因型各需一个
喷水瓶
金属勺/刮刀
细毛画笔			例如 "liner" 型画笔
玻璃凹面载片
PAP笔：Super PAP PEN IM3580	Beckman Coulter
载玻片			每张载玻片上需绘制5个或更多PAP笔方格；方格大小取决于显微镜成像物镜和相机放大倍数，例如2 mm的方格
湿盒			用于防止载玻片和孔板干燥：内壁和底部铺有湿润纸巾的密封容器
Schneider's 果蝇细胞培养基	Invitrogen
冷金属块			一种置于盛有冰块的桶中冷却的金属块（又称加热块）；优选黑色或其他深色、无反光的颜色
两支带针头的1 ml注射器（27G ½）	Becton Dickinson		用于解剖
可选：外科弹簧剪刀（切割刃长2 mm）	Fine Science Tools
玻璃珠，212–600 微米	Sigma
2 ml Eppendorf离心管	Eppendorf		每种待评估基因型各需一支
涡旋混合器	Fisher Scientific
表达荧光标记血细胞的转基因果蝇幼虫。适用的转基因包括：HmlΔ-DsRed（Makhijani 等，2011）、MSNF9mo-mCherry（Tokusumi 等，2009）、BcF6-CFP 和 -GFP（Gajewski 等，2007），或 HmlΔ-GAL4（Sinenko 和 Mathey-Prevot，2004）、Pxn-GAL4（Stramer 等，2005）、He-GAL4（Zettervall 等，2004）、Crq-GAL4（由 H. Agaisse 提供，Stramer 等，2005），或 eater-GAL4（Tokusumi 等，2009）与 UAS-GFP 或其他荧光蛋白转基因组合使用
荧光体视显微镜	Leica		此处使用 Leica M205，可选配相机、成像软件和测量模块
配备相机的倒置荧光显微镜	Leica 或 Keyence		可带或不带拼接扫描功能（例如 Leica DMI 系列、Keyence BIOREVO BZ-9000 系列）