一种用于分析SIV特异性CD8+记忆T细胞的肽-MHC-I四聚体染色技术

摘要

来源：Gonzalez-Nieto, L.，等。通过肽-MHC-I四聚体染色法分析恒河猴中猴免疫缺陷病毒特异性CD8⁺ T细胞。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种利用肽-主要组织相容性复合物I类（pMHC-I）四聚体来表征特异性针对猴免疫缺陷病毒（SIV）的CD8⁺记忆T细胞的方法。pMHC-I四聚体是由四个MHC-I分子与SIV特异性肽段结合并偶联荧光染料所形成的复合物。这些四聚体可特异性地结合SIV特异性的CD8⁺ T细胞表面的T细胞受体（TCRs），从而实现对这类细胞的鉴定与分析。

方案

1. PKI 处理

注意：此步骤为可选，但建议用于Mamu-B*017:01四聚体。

1. 将PBMC重悬于R10培养基中，细胞浓度为1.6 × 10⁷ 个细胞/ml。
2. 向相应的流式细胞术管中加入50 µl该细胞悬液。每管中加入50 µl浓度为100 nM的PKI溶液。
3. 涡旋混匀各管，37 °C孵育30分钟。此步骤结束时，每管应含有100 µl细胞悬液，其中包含8.0 × 10⁵ 个PBMC和50 nM的PKI。
4. 进行pMHC-I四聚体染色步骤。

2. 使用荧光染料标记的pMHC-I四聚体进行染色

1. 在制备pMHC-I四聚体主混合液之前，将pMHC-I四聚体管在4 °C条件下以20,000 × g离心至少15分钟。此步骤的目的是沉淀pMHC-I四聚体溶液中的蛋白质聚集体，以减少可能增加的背景染色。离心完成后，应避免从管底吸取液体，以防吸入已沉淀的蛋白质聚集体。
2. 准备足够的pMHC-I四聚体混合液以用于所有实验管的染色。为避免移液误差，该混合液的总体积需额外多准备15%。
3. 将pMHC-I四聚体用染色缓冲液稀释（例如， Brilliant 染色缓冲液），使得每项检测中加入 25 µl pMHC-I 四聚体预混液。
   1. 每个检测使用两个pMHC-I四聚体标记PBMC；其中一个与别藻蓝蛋白（APC）偶联，另一个与 Brilliant Violet (BV) 421 偶联。
4. 加入 8.0 × 10⁵ 将PBMC加入相应的流式细胞术检测管中，终体积为100 µl。如果细胞已接受上述PKI处理，则在此步骤中应已重悬于100 µl体积中。
5. 向相应的流式细胞管中加入 25 µl pMHC-I 四聚体预混液。此步骤结束时，每管中的终体积应为 125 µl。
6. 涡旋振荡各管，以混匀细胞悬液。
7. 室温避光孵育45分钟。在此45分钟孵育期间，配制表面染色单克隆抗体（mAb）混合液。

3. 表面染色

1. 准备足够的单克隆抗体（mAb）混合液以染色所有实验管。为避免移液误差，该混合液的总体积应额外多准备15%。
2. 用染色缓冲液调整混合液的体积，使每个检测中加入 50 µl。
3. 为正确排除非CD8⁺ T细胞及其记忆亚群的界定，在表面染色主混合液中使用针对以下分子的抗体，其用量需经滴定确定。
   注意： 每种单克隆抗体偶联的荧光染料如下所示：CD14 BV 510、CD16 BV 510、CD20 BV 510、CD8α BV 785、CD28 PE Cy7 和 CCR7 FITC。请注意，针对 CD14、CD16 和 CD20 的单克隆抗体均偶联了相同的荧光染料（BV 510）即， BV 510），因为它们将被纳入“倾出”门。
4. 在表面染色主混合液中加入可固定的染料以区分死细胞即， 胺反应性染料（ARD）。确保ARD试剂偶联的荧光染料具有与“倾倒门”（dump gate）中所用荧光染料相似的发射光谱。本实验中使用ARD Aqua。
5. 向相应的流式细胞术管中加入50 µl 3.1-3.4节所述的染色主混合液。此步骤结束时，每管中的终体积应为175 µl。
6. 涡旋混匀各管。室温避光孵育25分钟。
7. 用洗涤缓冲液（含0.1%牛血清白蛋白和0.45 g/L NaN3的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液）洗涤细胞。
   警告： 叠氮化钠（NaN₃）是一种有毒物质。即使接触微量也可能引发症状。请依照开展实验的机构环境健康与安全办公室（EHS）规定指南操作该物质。
8. 以 510 × g 离心 5 分钟。小心将上清液倾入单独的废液容器中，注意不要扰动沉淀。
   注意： 切勿将含有叠氮化钠的洗涤缓冲液上清液倒入含漂白剂的废液容器中，因为两者可能发生反应并产生有毒气体。有关叠氮化钠的处置方法，请联系开展实验所在机构的环境健康与安全部门（EHS Office）获取指导。
9. 倾析后，将各管中残留液体中的细胞涡旋混匀。

4. 细胞固定

1. 向所有试管中加入 250 µl 的 2% 多聚甲醛（PFA）溶液以固定细胞。
   注意：PFA 为有毒物质，即使微量暴露也可能引发症状。操作该物质时，必须遵循实验所在机构 EHS 办公室规定的安全指南。
   1. 由于 2% PFA 溶液必须与细胞等渗，需使用 PBS 配制该溶液。100 毫升的 2% PFA 溶液足以用于多次实验。加入 2% PFA 后应立即彻底涡旋混匀所有试管，以防止细胞聚集体的形成。
2. 在 4 °C 避光孵育 20 分钟。
3. 通过重复步骤 3.7–3.9 洗涤细胞。此步骤完成后，细胞可在 4 °C 避光保存 24–48 小时。在进入透化阶段前，需彻底涡旋混匀各试管。

5. 细胞通透化

1. 加入 500 µl 通透缓冲液。涡旋振荡所有管子。
2. 室温避光孵育 10 分钟。
3. 重复步骤 3.7–3.9 洗涤细胞。

6. 胞内染色

1. 准备足够的单克隆抗体主混合液，以用于所有实验管的染色。
2. 用 PBS 或染色缓冲液调整体积，使每项检测加入 50 µl 胞内单克隆抗体主混合液。
3. 使用已滴定浓度的抗 CD3 和颗粒酶 B（Gzm B）单克隆抗体，配制第 6.1 和 6.2 步所述的单克隆抗体主混合液。
   注意：pMHC-I 四聚体对 TCR 的结合可导致 CD3 内化，若将抗 CD3 单克隆抗体加入表面染色主混合液中，可能干扰四聚体阳性且 CD3⁺ CD8⁺ T 细胞的检测。为避免此问题，应在细胞透化后的本步骤中加入抗 CD3 单克隆抗体。以下列出各单克隆抗体偶联的荧光染料作为参考：CD3 PerCP Cy5.5 和 Gzm B PE。
4. 向相应管中加入 50 µl 单克隆抗体混合液。避光室温孵育 30 分钟。
5. 重复步骤 3.7–3.9 洗涤细胞。此时各管即可用于流式细胞仪检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
达沙替尼	轴突药物化学	轴突 1392	必须用DMSO重悬，并立即在-20°C下保存
含谷氨酰胺的RPMI培养基	Gibco / Life Technologies	61870-036	必须在 4 °C 下储存
热灭活胎牛血清	Gibco / Life Technologies	10082-147	必须在 4 °C 下保存
青霉素-链霉素-两性霉素B	Lonza	17-745E	必须在 4 °C 下储存
DMSO，无水	Life Technologies	D12345	室温保存。
5 mL 圆底聚丙烯管	VWR	60819-728
荧光染料偶联的pMHC-I四聚体	美国国立卫生研究院四聚体核心（NIH Tetramer Core）或 MBL 公司		必须储存和维持在  4 °C。使用前在20,000 x g离心15分钟。切勿冷冻。
荧光染料偶联的单克隆抗体	多家公司		必须储存和维持在  4 °C。切勿冷冻。
活/死 可固定活细胞染料Aqua 死亡 细胞染色试剂盒	Life Technologies	l34957	必须在 -20 °C 下储存。使用前，将每份样品用 50 μL DMSO 重悬。
Brilliant Stain 缓冲液	BD生物科学	563794	必须储存在  4 °C
磷酸盐缓冲液	VWR	97064-158	室温保存
牛血清白蛋白	VWR	700011-230	必须储存在  4 °C
叠氮化钠	VWR	97064-646	室温保存。有毒物质。禁止与漂白剂混合。
漂白剂	VWR	89501-620	腐蚀性化学品，不可与叠氮化钠混合。请小心操作。
多聚甲醛	电子显微镜科学公司	15714-S	易燃、腐蚀性及有毒试剂，操作时需谨慎
聚山梨酯20（Tween-20）	Alfa Aesar	L15029	室温保存
通透溶液2	BD生物科学	340973	有毒且具腐蚀性的试剂。请小心操作
Sarsdet 1.5 mL 螺口管	VWR	72.692.005
2.0 ml DNA/RNA低吸附管	Eppendorf	22431048	建议使用无菌微量离心管
涡旋混合器
生物安全柜
Milli Q 综合型水净化系统	EMD Millipore	ZRXQ010WW	可使用任何供应商提供的分子生物学级水
微型离心机
离心
4 °C  冰箱
BD LSR II	BD 生物科学		流式细胞仪必须配备与所用染色 panel 相匹配的激光器和滤光片。
去离子水
铝箔	VWR SCIENTIFIC INC.	89068-738
培养箱			必须能够维持 37 °C  内部温度
FACS Diva 软件	BD 生物科学
Flowjo 软件版本 9.6	Flowjo		用于分析由 FACS Diva 软件生成的 FCS 文件
微量移液器吸头