一种用于分析SIV特异性CD8+记忆T细胞的肽-MHC-I四聚体染色技术

摘要

来源：Gonzalez-Nieto, L.，等。通过肽-MHC-I四聚体染色法分析恒河猴中猴免疫缺陷病毒特异性CD8⁺ T细胞。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种利用肽-主要组织相容性复合物I类（pMHC-I）四聚体来表征特异性针对猴免疫缺陷病毒（SIV）的CD8⁺记忆T细胞的方法。pMHC-I四聚体是由四个MHC-I分子与SIV特异性肽段结合并偶联荧光染料所形成的复合物。这些四聚体可特异性地结合SIV特异性的CD8⁺ T细胞表面的T细胞受体（TCRs），从而实现对这类细胞的鉴定与分析。

方案

1. PKI 处理

注意：此步骤为可选，但建议用于Mamu-B*017:01四聚体。

1. 将PBMC重悬于R10培养基中，细胞浓度为1.6 × 10⁷ 个细胞/ml。
2. 向相应的流式细胞术管中加入50 µl该细胞悬液。每管中加入50 µl浓度为100 nM的PKI溶液。
3. 涡旋混匀各管，37 °C孵育30分钟。此步骤结束时，每管应含有100 µl细胞悬液，其中包含8.0 × 10⁵ 个PBMC和50 nM的PKI。
4. 进行pMHC-I四聚体染色步骤。

2. 使用荧光染料标记的pMHC-I四聚体进行染色

1. 在制备pMHC-I四聚体主混合液之前，将pMHC-I四聚体管在4 °C条件下以20,000 × g离心至少15分钟。此步骤的目的是沉淀pMHC-I四聚体溶液中的蛋白质聚集体，以减少可能增加的背景染色。离心完成后，应避免从管底吸取液体，以防吸入已沉淀的蛋白质聚集体。
2. 准备足够的pMHC-I四聚体混合液以用于所有实验管的染色。为避免移液误差，该混合液的总体积需额外多准备15%。
3. 将pMHC-I四聚体用染色缓冲液稀释（例如

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
达沙替尼	轴突药物化学	轴突 1392	必须用DMSO重悬，并立即在-20°C下保存
含谷氨酰胺的RPMI培养基	Gibco / Life Technologies	61870-036	必须在 4 °C 下储存
热灭活胎牛血清	Gibco / Life Technologies	10082-147	必须在 4 °C 下保存
青霉素-链霉素-两性霉素B	Lonza	17-745E	必须在 4 °C 下储存
DMSO，无水	Life Technologies	D12345	室温保存。
5 mL 圆底聚丙烯管	VWR	60819-728
荧光染料偶联的pMHC-I四聚体	美国国立卫生研究院四聚体核心（NIH Tetramer Core）或 MBL 公司		必须储存和维持在  4 °C。使用前在20,000 x g离心15分钟。切勿冷冻。
荧光染料偶联的单克隆抗体	多家公司		必须储存和维持在  4 °C。切勿冷冻。
活/死 可固定活细胞染料Aqua 死亡 细胞染色试剂盒	Life Technologies	l34957	必须在 -20 °C 下储存。使用前，将每份样品用 50 μL DMSO 重悬。
Brilliant Stain 缓冲液	BD生物科学	563794	必须储存在  4 °C
磷酸盐缓冲液	VWR	97064-158	室温保存
牛血清白蛋白	VWR	700011-230	必须储存在  4 °C
叠氮化钠	VWR	97064-646	室温保存。有毒物质。禁止与漂白剂混合。
漂白剂	VWR	89501-620	腐蚀性化学品，不可与叠氮化钠混合。请小心操作。
多聚甲醛	电子显微镜科学公司	15714-S	易燃、腐蚀性及有毒试剂，操作时需谨慎
聚山梨酯20（Tween-20）	Alfa Aesar	L15029	室温保存
通透溶液2	BD生物科学	340973	有毒且具腐蚀性的试剂。请小心操作
Sarsdet 1.5 mL 螺口管	VWR	72.692.005
2.0 ml DNA/RNA低吸附管	Eppendorf	22431048	建议使用无菌微量离心管
涡旋混合器
生物安全柜
Milli Q 综合型水净化系统	EMD Millipore	ZRXQ010WW	可使用任何供应商提供的分子生物学级水
微型离心机
离心
4 °C  冰箱
BD LSR II	BD 生物科学		流式细胞仪必须配备与所用染色 panel 相匹配的激光器和滤光片。
去离子水
铝箔	VWR SCIENTIFIC INC.	89068-738
培养箱			必须能够维持 37 °C  内部温度
FACS Diva 软件	BD 生物科学
Flowjo 软件版本 9.6	Flowjo		用于分析由 FACS Diva 软件生成的 FCS 文件
微量移液器吸头