一种基于层流的测定法，用于研究白细胞和内皮细胞之间的相互作用

摘要

来源:Vajen， T. 等人。基于层流的测定法，用于研究培养的血管细胞和贴壁血小板上的白细胞募集。J. Vis. Exp.（2018 年）。

该视频演示了一种基于层流的分析，用于表征白细胞和细胞伴侣（如内皮细胞）的相互作用。该方法提供了对白细胞在完整和汇合的血管细胞层上灌注时的粘附、脱粘和迁移的动态见解。

方案

1. 白细胞的荧光标记和灌注（人使用 PMN 或 THP-1，基于小鼠流式分析的 RAW264.7 或原代小鼠单核细胞）

1. 荧光标记
   1. 用细胞通透性绿色荧光核酸染色剂 （1 μM） 标记白细胞 （1 x 10⁶/mL）。将细胞在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   2. 用 PBS 以 300 x g 离心 5 分钟洗涤细胞，并在检测缓冲液中将细胞悬浮至 0.5 x 10⁶ 个细胞/mL 的浓度（每个测试条件 5 mL，取决于流速）。
2. 流通室分析制备
   1. 对于细胞单层上的白细胞粘附，从培养皿中丢弃细胞培养基，并将其组装到流动室中。将管道连接到注射器。对于固定血小板上的白细胞粘附，请将微玻片连接到注射器。将水浴预热至 37 °C。
   2. 取灌注注射器 （50 mL），将注射器安装在注射器支架上，然后将泵设置为抽出模式。将泵体积设置为 0 mL，并将 50 mL 注射器的直径设置为 26.70 mm。
   3. 将弯头鲁尔接头连接到管路的一端。将鲁尔锁耦合器放在注射器上，并将带有弯头鲁尔接头的管路连接到鲁尔锁耦合器。将自由管路端连接到流通室。
3. 白细胞灌注和粘附
   1. 对于细胞单层上的白细胞粘附，从培养皿中丢弃细胞培养基，并将其组装到流动室中。将管道连接到注射器。对于固定血小板上的白细胞粘附，请将微玻片连接到注射器。
   2. 对于血管或血小板单层上的白细胞灌注和粘附，将第二根管路放入含有检测缓冲液的 50 mL 锥形管中，并用 1 mL 移液管填充管路，然后挤压管路并将其连接到流动室。
   3. 在白细胞灌注之前，向细胞悬液中加入 3 mM CaCl₂ 和 2 mM MgCl₂，并在 37 °C 下孵育 5 分钟。
   4. 在细胞灌注之前灌注检测缓冲液，以去除腔室和管道中可能的空气。
   5. 通过拧紧管端并将管路从检测缓冲液切换到细胞悬液来封闭管端，防止气泡被捕获。以适当的流速/剪切应力灌注细胞，直到第一批细胞到达。
   6. 以适当的流速/剪切应力灌注细胞 2 分钟，并使用连接到数字 CCD 或 CMOS 相机的 100 倍放大倍率，使用倒置相差/荧光显微镜（例如 EVOS-FL）在 2-6 分钟之间捕获至少 6 张滚动和贴壁细胞的照片><。 注意:流速/剪切应力取决于流室尺寸和灌注液的粘度。对于此处使用的灌注室（见材料表）:
      τ=η*97.1*Φ
      τ: 剪切应力 （1 dyn/cm²）
      η:粘度 （0.015 dyn*s/cm²）
      Φ:流速 （0.67 mL/min）
4. 白细胞脱粘
   1. 对于脱粘，通过挤压管路将管路从细胞悬液切换到检测缓冲液，以防止气泡被捕获。
   2. 通过用具有适当流速/剪切应力的测定缓冲液灌注来分离细胞（参见 3.3.7 注释）。
5. 白细胞迁移
   1. 对于白细胞迁移，灌注白细胞（步骤 3），直到有足够数量的白细胞粘附（~50 个细胞/视野）。
   2. 用检测缓冲液代替白细胞悬液。
   3. 在 37 °C 下每 10-15 秒延时记录 30-60 分钟的迁移细胞。

材料