一种基于层流的白细胞与内皮细胞相互作用研究方法

摘要

来源：Vajen, T.，等。基于层流的实验方法用于研究白细胞在培养的血管细胞和黏附血小板上的募集。 J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种基于层流的检测方法，用于表征白细胞与其细胞伙伴（如内皮细胞）之间的相互作用。该方法可在白细胞流经完整且融合的血管细胞层时，动态观察其黏附、去黏附及跨内皮迁移过程。

方案

1. 白细胞（人源性中性粒细胞PMN或THP-1细胞，以及小鼠源性RAW264.7细胞或原代小鼠单核细胞）的荧光标记与灌注

1. 荧光标记
   1. 用细胞膜通透性绿色荧光核酸染料（1 µM）对标记白细胞（1 × 10⁶/mL）。在37 °C下孵育30分钟。
   2. 通过在300 × g下离心5分钟，用PBS洗涤细胞，并将细胞重悬于检测缓冲液中，浓度为0.5 × 10⁶ 个细胞/mL（每个检测条件5 mL，取决于流速）。
2. 流动腔实验准备
   1. 对于白细胞在细胞单层上的黏附，弃去培养皿中的细胞培养基，并将其组装进流动腔。将管路连接至注射器。对于白细胞在固定化血小板上的黏附，将微载玻片连接至注射器。将水浴预热至37 °C。
   2. 取一个灌注注射器（50 mL），将其安装在注射器支架上，并将泵设置为抽取模式。将泵体积设为0 mL，并为50 mL注射器设置直径为26.70 mm。
   3. 将一个弯头鲁尔接头连接到管路的一端。将鲁尔锁紧耦合器安装到注射器上，并将带有弯头鲁尔接头的管路连接至鲁尔锁紧耦合器。将管路的自由端连接至流动腔。
3. 白细胞灌注与黏附
   1. 对于白细胞在细胞单层上的黏附，弃去培养皿中的细胞培养基，并将其组装进流动腔。将管路连接至注射器。对于白细胞在固定化血小板上的黏附，将微载玻片连接至注射器。
   2. 对于白细胞在血管或血小板单层上的灌注与黏附，将第二根管路插入含有检测缓冲液的50 mL锥形管中，用1 mL移液器将管路充满液体，然后挤压管路并将其连接至流动腔。
   3. 在白细胞灌注前，向细胞悬液中加入3 mM CaCl₂和2 mM MgCl₂，并在37 °C下孵育5分钟。
   4. 在细胞灌注前，先用检测缓冲液灌注，以去除腔体和管路中可能存在的气泡。
   5. 通过捏紧管路末端，将管路从检测缓冲液切换至细胞悬液，防止气泡滞留。以适当的流速/剪切应力灌注细胞，直至首个细胞到达。
   6. 以适当的流速/剪切应力继续灌注细胞2分钟，并使用连接数字CCD或CMOS相机的倒置相差/荧光显微镜（例如，EVOS-FL），在100倍放大倍数下，于灌注后2–6分钟内至少拍摄6张滚动和黏附细胞的图像。
      注：流速/剪切应力取决于流动腔的尺寸和灌注液的黏度。对于本实验所用的灌注腔（见材料表）：
      τ=η×97.1×Φ
      τ：剪切应力（1 dyn/cm²）
      η：黏度（0.015 dyn·s/cm²）
      Φ：流速（0.67 mL/min）
4. 白细胞去黏附
   1. 进行去黏附时，通过捏紧管路将管路从细胞悬液切换至检测缓冲液，防止气泡滞留。
   2. 通过以适当的流速/剪切应力灌注检测缓冲液，使细胞脱离（参见3.3.7节注释）。
5. 白细胞跨内皮迁移
   1. 进行白细胞跨内皮迁移实验时，灌注白细胞（步骤3），直至有足够数量的白细胞黏附（约每视野50个细胞）。
   2. 将白细胞悬液更换为检测缓冲液。
   3. 在37 °C下，每隔10–15秒进行一次延时录像，持续记录30–60分钟，以观察迁移过程中的细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
倒置荧光显微镜，例如 EVOS-FL	Life Technologies Europe bv
泵，例如型号：210-CE	world precision instruments	78-9210W
Falcon 35 mm 经组织培养处理的 EasyGrip 型细胞培养皿	corning	353001
50 mL 注射器	Becton Dickinson	300137
硅胶管	VWR	228-0700
弯头鲁尔接头，雄性	Ibidi	10802
雌性鲁尔锁紧耦合器	Ibidi	10823
流动腔室	亚琛工业大学附属医院	专利 DE10328277A1：Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD。用于体外研究细胞表面生理过程的流动腔室。2005年。
Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源	Life Technologies Europe bv	A1048301
重组人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）	Peprotech	300-01A
肽6血栓调节蛋白受体激活剂（TRAP-6）	Anaspec / Eurogentec	24191
SYTO 13 绿色荧光核酸染料	Life Technologies Europe bv	S7575
二水合氯化钙	Merck	102382
六水合氯化镁	Sigma-Aldrich Chemie	M2670
小鼠单核细胞/巨噬细胞 RAW264.7	ATCC	TIB-71
高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）	Gibco	11965092