$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 纳米结构制备
- 选择直径为 25 mm、厚度约为 170 µm（No. 1.5）的玻璃盖玻片作为纳米加工的基底。
- 将盖玻片浸入piranha溶液（硫酸与过氧化氢体积比为3:1）中至少6小时。用大量超纯18.2 MΩ去离子蒸馏水（DDW）清洗浸泡过piranha溶液的盖玻片。
注意： piranha溶液与有机物剧烈反应，必须极其小心地操作。
- 通过电子束蒸发在盖玻片上沉积10 nm厚的铬薄膜，以避免在纳米结构的图形化和成像过程中产生电荷效应。
- 以2,000 rpm转速旋涂双层抗蚀剂的第一层（乙基乳酸甲基丙烯酸甲酯共聚物，MMA_EL6）45秒，随后在150 °C下烘烤；再以3,000 rpm转速旋涂第二层聚甲基丙烯酸甲酯（950PMMA_A2）45秒，随后在180 °C下烘烤。
- 使用电子束光刻（EBL）在25 kV条件下对双层抗蚀剂进行图形化，曝光剂量为300 µC/cm2。在异丙醇（IPA）/甲基异丁基酮（MIBK）溶液（体积比2:1）中显影，然后用IPA冲洗。
- 使用电子束蒸发仪在基底上沉积Ti（5 nm）/Au（80 nm）薄膜。
- 在金膜沉积完成后，将基底浸泡于丙酮中4小时，以剥离共聚物双层抗蚀剂。
- 使用扫描电子显微镜（SEM）检查基底，确认纳米结构的形状和尺寸；随后在室温下使用CR-7刻蚀液进行湿法刻蚀60秒，去除基底上残留的铬层，最后用DDW冲洗。
- 设计中心间距为33 µm的阵列布局，以便在阵列之间留出细胞成像空间。使用电子束曝光系统将每个阵列中的纳米结构排列为20 × 20的图案，节距为300 nm。每块芯片包含300个阵列，纳米结构典型尺寸为高度80±2.5 nm，直径70±2.5 nm。
- 使用原子力显微镜（AFM）检测部分阵列，以验证其尺寸和均匀性。
- 使用紫外固化环氧树脂将一个支撑环（通常为硅材料）固定在盖玻片背面。
2. 芯片清洗与自组装单分子层的施加
- 清洗和再生芯片时，先在相同条件下以 40 W 功率、300 mTorr 压力的混合气体（含 5% 氢气和 95% 氩气）对腔室清洗 5 分钟，随后对芯片进行 45 秒的等离子体灰化处理。
- 等离子体灰化后立即对金纳米结构进行功能化：将芯片浸入由两种组分组成的乙醇硫醇溶液中，该溶液中 SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO) 与含氨基或羧基官能团的组分按 3:1 的比例混合，后者分别为 SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN) 或 SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)。
- 将芯片置于硫醇溶液中过夜，以形成自组装单分子层（SAM）。
- 用乙醇冲洗芯片，并用氮气吹干。
- 如有需要，可将功能化后的芯片在 4 °C 下保存最多两周。
- 使用前，根据所选配体的类型，采用相应的化学方法使 SPN 或 SPC 组分与配体发生反应（见下文）。
注意：芯片可反复再生和重新功能化数十次。单个芯片的使用周期可长达 6 个月至一年以上。在同一芯片阵列上，经过多次等离子体灰化再生并重新进行生物功能化后，所测得的光谱结果具有良好的可重复性。
3. 表面功能化与动力学表征
注意：使用商业 SPR 仪器中的功能化芯片来表征配体与分析物之间的动力学速率常数，并研究自组装单分子层（SAM）抵抗非特异性结合的能力。存在多种流速和微流控设计，可实现高效的表面功能化。由于我们使用的是商用 SPR 仪器，因此我们采用其推荐的流速作为标准。需要说明的是，这些流速在所有 SPR 仪器中均属典型值，因此并不具有限制性。虽然 SPR 仪器并非必需，因为所有功能化步骤均可直接在局域表面等离子体共振成像（LSPR）芯片上完成，但使用 SPR 仪器确实减轻了我们的工作负担，因其为多通道仪器，而我们的 LSPR 微流控装置则不具备此功能。
- 按照第2节所述，将自组装单分子膜（SAM）修饰到商用裸金芯片上。
- 若使用基于SPC的SAM，用133 mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）与33 mM的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）等体积混合液活化羧基。 N在 DDW 中孵育 10 分钟以去除羟基琥珀酰亚胺（NHS）。
- 将活化的羧基与目标抗体/配体在 pH 6 的磷酸盐缓冲液中（通常情况，但可根据分子特性调整）以 30 µl/min 的流速反应 300 秒进行偶联。
- 配体偶联后，以30 µl/min的流速在300秒内流加0.1 M磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）中的乙醇胺，作为失活步骤。乙醇胺有助于减少非特异性结合。
- 以100 µl/min的流速引入一系列浓度的目标分析物，并使用动力学分析软件计算动力学速率常数。
- 如果非特异性结合问题显著，可提高SPO与SPC或SPN的比例。
4. LSPR 通用设置
- 显微镜设置：
- 使用100 W卤素灯对样品进行科勒照明。在光路中使用长通滤光片（通常截止波长为593 nm），以消除不引起共振位移的波长（图1）。
- 进行LSPRi数据采集时，使用配备40倍油浸物镜（1.4 NA）和热电冷却的16位CCD相机的倒置显微镜。
- 在显微镜输出端口处安装分束器，以同时获取图像和光谱。
- 将温控显微镜载物台设定为37 °C，并平衡4小时。
- 在显微镜上加装额外的培养装置，以将CO2浓度和湿度分别调节至5%和95%。
- 芯片制备与安装：
- 根据第2节所述方法，使用SPR实验确定的最佳双组分自组装单分子膜（SAM）比例对LSPR芯片进行功能化处理。
- 将芯片装入定制的微流控夹具中，具体步骤如下：将芯片置于铝制底座上，用硅胶垫片和透明塑料顶片夹住芯片，并用4个螺钉固定组件。
- 对于典型的基于SPC的硫醇应用，采用滴涂法加入300 µl DDW中含133 mM EDC和33 mM NHS的1:1混合溶液，以活化SPC硫醇组分中的羧基。
- 静置10分钟后，手动用10 mM PBS冲洗表面。
- 通过滴涂300 µl配体溶液，将活化的羧基与目标配体（通常为抗体或抗体片段）偶联。
- 静置30分钟后，手动用10 mM PBS冲洗。
- 在芯片上滴涂300 µl PBS中含0.1 M乙醇胺的溶液，以减少非特异性结合。静置10分钟。
- 用含0.005% Tween 20的PBS（PBS-T20）冲洗乙醇胺。
- 在芯片上方放置一块石英片，以减少因弯月面变化引起的数据波动。
- 在将芯片安装到显微镜上时，始终保持芯片被PBS-T20缓冲液润湿。
- 将LSPR芯片组件牢固地放入加热载物台的样品架中，并连接微流控管路。
- 将微流控管路连接至组件，并通入缓冲液（或细胞实验中的无血清培养基），直至达到稳态。
- 使组件和显微镜至少平衡2小时。
- 使用操纵杆调整芯片位置，使中央阵列与用于光谱分析的光纤对齐。光谱数据通过光谱仪和光谱分析软件采集。
- 在整个实验过程中，使用软件自动对焦、Zeiss Definite Focus或等效的自动对焦装置保持阵列处于焦点位置。
5. 9E10 杂交瘤细胞分泌抗 c-myc 抗体的 LSPR 成像
注意：本研究使用的杂交瘤细胞系可组成型表达抗c-myc抗体，因此无需化学诱导剂
- 用 c-myc 肽对纳米结构进行功能化修饰。该肽与 9E10 杂交瘤细胞克隆分泌的抗 c-myc 抗体的解离常数（KD）为 1.77 nM。
- 在含有 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 抗生素的完全培养基中，将杂交瘤细胞于 T75 培养瓶中在 37 °C、5% CO2 条件下培养。维持细胞密度为 4 ×105 个细胞/ml。
- 进行细胞分泌研究时，通过离心从 T75 培养瓶中收集细胞，用无血清 RPMI-1640 培养基（SFM）洗涤两次以去除已分泌的抗体，并将细胞密度调整至 4 ×106 个细胞/ml。
- 收集细胞并在接种到局域表面等离子体共振（LSPR）芯片前检测细胞活力。
- 使用微量移液器手动将 50 µl 细胞悬液加至 LSPR 芯片表面。数分钟后，约有 25 至 50 个细胞黏附于 LSPR 芯片表面。
- 利用微流控灌注系统，用新鲜的 SFM 洗去未黏附的悬浮细胞。
- 选择与细胞距离较近（在 10 μm 范围内）但未与细胞重叠的 LSPR 阵列进行成像。
- 为确保信号特异性来源于分泌的抗 c-myc 抗体，需分别引入含有或不含抗体的细胞培养基，以及在溶液中加入过量 c-myc 肽以饱和结合位点、阻断抗体结合能力的抗体样本进行对照实验。
- 每次实验结束后，使用饱和浓度的抗 c-myc 抗体溶液（250 nM）对传感器进行校准。这有助于标准化传感器响应，并根据每次实验的生物功能化特性确定结合位点的占有率。
- 使用图像配准软件校正 X 和 Y 方向的漂移。
