基于局域表面等离子体共振成像的单细胞蛋白分泌检测

摘要

来源：Raghu, D. 等，一种用于单细胞分泌物时空成像的无标记技术。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了利用局域表面等离子体共振成像技术检测单个细胞分泌的蛋白质。通过微流控装置和带有肽段的等离子体纳米结构芯片，在共振角度下反射光强度的变化可反映出与单个细胞分泌蛋白之间的相互作用。

方案

1. 纳米结构制备

1. 选择直径为 25 mm、厚度约为 170 µm（No. 1.5）的玻璃盖玻片作为纳米加工的基底。
2. 将盖玻片浸入piranha溶液（硫酸与过氧化氢体积比为3:1）中至少6小时。用大量超纯18.2 MΩ去离子蒸馏水（DDW）清洗浸泡过piranha溶液的盖玻片。
   注意： piranha溶液与有机物剧烈反应，必须极其小心地操作。
3. 通过电子束蒸发在盖玻片上沉积10 nm厚的铬薄膜，以避免在纳米结构的图形化和成像过程中产生电荷效应。
4. 以2,000 rpm转速旋涂双层抗蚀剂的第一层（乙基乳酸甲基丙烯酸甲酯共聚物，MMA_EL6）45秒，随后在150 °C下烘烤；再以3,000 rpm转速旋涂第二层聚甲基丙烯酸甲酯（950PMMA_A2）45秒，随后在180 °C下烘烤。
5. 使用电子束光刻（EBL）在25 kV条件下对双层抗蚀剂进行图形化，曝光剂量为300 µC/cm²。在异丙醇（IPA）/甲基异丁基酮（MIBK）溶液（体积比2:1）中显影，然后用IPA冲洗。
6. 使用电子束蒸发仪在基底上沉积Ti（5 nm）/Au（80 nm）薄膜。
7. 在金膜沉积完成后，将基底浸泡于丙酮中4小时，以剥离共聚物双层抗蚀剂。
8. 使用扫描电子显微镜（SEM）检查基底，确认纳米结构的形状和尺寸；....

结果

图1. 光学装置。 来自卤素灯的照明光首先通过一个长通滤光片（LP）进行过滤。该光被线性偏振（P1），并通过一个40X/1.4 NA的物镜照射样品。散射光由同一物镜收集，并通过一个正交偏振片（P2）。在收集的光路中插入一个50/50的分束器（BS），以实现光谱和成像的同步分析。右上角：九个独立纳米结构的原子力显微镜图像，纳米结构之间的间距为300 nm。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25 mm 直径玻璃盖玻片	Bioscience Tools	CSHP-No1.5-25	最佳厚度为 170±5 µm
聚甲基丙烯酸甲酯	Microchem	PMMA 950 A4
乳酸乙酯甲基丙烯酸甲酯	Microchem	MMA EL6
电子束蒸发仪	Temescal	FC-2000
电子束光刻系统	Raith	Series 150
乙醇	Sigma-Aldrich	459836
丙酮	Sigma-Aldrich	320110
CR-7 铬蚀刻剂	Cyantek	CR-7
扫描电子显微镜	Zeiss	Ultra 55
原子力显微镜	Veeco	Nanoscope III
等离子灰化系统	Technics	Series 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)	Prochimia	TH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)	Prochimia	TH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)	Prochimia	TH 002-m11.n3-0.2
表面等离子体共振系统	Biorad	XPR36
裸金芯片	Biorad	GLC 芯片	经等离子灰化处理以去除单分子层
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺	Thermo	22980
N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)	Thermo	24510
戊胺-生物素	Thermo	21345
乙醇胺	Sigma-Aldrich	E9508
中性亲和素	Thermo	31000
磷酸盐缓冲液	Thermo	28374
吐温 20	Sigma-Aldrich	P2287
倒置显微镜	Zeiss	Axio Observer	显微镜配备 40X 油浸物镜；CO2 及湿度培养系统来自 Pecon GmbH
CCD 相机	Hamamatsu	Orca R2	热电制冷（16 位）
光谱仪	Ocean Optics	QE65Pro
Spectrasuite	Ocean Optics	version1.4
c-myc 肽 HyNic 标签	Solulink	SP-E003
单克隆抗 c-myc 抗体	Sigma-Aldrich	M4439
杂交瘤细胞系	ATCC	CRL-1729
抗生素-抗真菌溶液 (100×)	Sigma-Aldrich	A5955
无血清 RPMI 1640 培养基	Invitrogen	11835-030
胎牛血清	ATCC	30-2020
罗丹明 DHPE	Life Technologies	L-1392