使用基于图像的微量中和试验分析病毒间的抗原关系

摘要

来源：Lin, Y.，等 定量微量中和试验的优化。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了基于成像的微量中和试验，用于分析甲型与乙型流感病毒之间的抗原关系。该方法可定量且直观地评估抗体或其他治疗方法在预防病毒感染方面的有效性。

方案

1. 病毒滴定

注意：根据病毒数量和重复次数，可灵活设置孔板：（1）病毒稀释可沿行或列方向进行（图1），每种病毒应占据独立的行或列；（2）病毒稀释梯度可灵活设定，但最高病毒浓度应始于左上角；（3）重复次数无限制。

1. 将足量的MDCK细胞或MDCK-SIAT细胞8接种至96孔板中（每孔200 µl）。于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞₂ 培养2至3天至细胞融合。使用添加10%热灭活胎牛血清（FCS）及抗生素（100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素）的DMEM培养基进行细胞传代。将SIAT细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养。₂ 和1 mg/ml G418硫酸盐。
   注意： 稀释倍数取决于实验经验及所使用的细胞系。细胞单层必须达到融合状态（即， MDCK细胞无细胞壁或可见轮廓，而MDCK-SIAT1细胞呈紧密排列状态）时进行病毒接种。根据MDCK或MDCK-SIAT1细胞融合培养瓶的传代情况，示例性稀释方法如下 表1.
2. 用 200 µl 病毒生长培养基（VGM）每孔洗涤细胞 3 次。使用 70% 乙醇对多孔板洗涤仪消毒 30 分钟，然后在洗涤前用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或 VGM 冲洗。
3. 吸出VGM，立即向每孔加入50 µl VGM。
4. 向6支无菌试管（或根据待测病毒数量及重复次数相应减少）中每支加入900 µl VGM。取100 µl病毒液加入第一支试管，充分混匀，并依次进行系列稀释，每次稀释均需更换吸头。每种待滴定病毒均按同样步骤重复操作。
   注意： 这将得到10倍系列稀释的病毒液^-1 至 10^-6.
5. 从最高稀释度（1 x 10）开始，向每个病毒稀释液中加入 50 µl^-5 在 图1），至重复孔（第9和第10列中 图196孔板的孔中。
6. 将培养板置于37 °C孵育2-3小时，使病毒侵染细胞。
   注意： 孵育2至3小时是必要的，以确保接种物中的病毒有足够时间到达单层细胞。
7. 制备覆盖层（每板10 ml）
   注意： 覆盖液由5 ml 2倍浓度DMEM、胰蛋白酶（终浓度2 µg/ml，20 µl 1 mg/ml 储液）和5 ml 纤维素棉短绒组成（参见材料列表）。
8. 移除接种物。
9. 加入覆盖液（每孔200 µl），在37 °C下静置孵育过夜。
   注意： 病毒出芽大约在4小时后开始，因此此后时间点内不得扰动培养板。
10. 吸出孔板中的覆盖液。
11. 加入预冷的含4%多聚甲醛的PBS A溶液（200 µl/孔），4 °C孵育30分钟，或室温孵育20分钟。
    注意PBS A 是自然pH值的磷酸盐缓冲盐水，含有10 g NaCl、0.25 g KCl、1.437 g Na₂HPO₄，0.25 g KH₂PO₄，以及1 L蒸馏水（参见材料列表）。
    注意: 聚甲醛吸入后有害，吞咽可导致灼伤。现有有限证据表明其具有致癌作用，且皮肤接触后可能引起致敏反应。
12. 吸去多聚甲醛，用 PBS A 洗涤两次（每孔 200 µl）。
13. 将培养板置于 PBS A 中，4 °C 保存以备后续使用，或继续进行以下步骤。
14. 加入破膜缓冲液（100 µl/孔），室温孵育30分钟。
15. 用 PBS A 洗涤平板两次（每孔 200 µl）。
16. 每孔加入50 µl第一抗体，即小鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体（1:1,000，溶于ELISA缓冲液），室温孵育1小时（或4 °C过夜），同时振荡。
17. 每孔用 100 µl 洗涤缓冲液（PBS A 中含 0.05% Tween 80，v/v）洗涤 3 次，每次洗涤之间于室温孵育 5 分钟。或者，每孔使用 300 µl 洗涤缓冲液，不孵育，直接洗涤 3 次。
18. 每孔加入50 µl二抗，即辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（以ELISA缓冲液按1:1,000稀释），室温下振荡孵育1小时。
19. 按照步骤1.17所述清洗3次。
20. 加入底物（50 µl/孔），室温孵育30分钟，或孵育至蓝色明显可见。
21. 为终止反应，每孔加入 200 µl 蒸馏水洗涤两次，每次洗涤之间在室温下孵育 2–3 分钟。
22. 将培养皿风干并置于暗处保存（例如， 用铝箔包裹。

2. 病毒中和

注意：计算中和试验所需的培养板数量。每块培养板可容纳一种病毒和多种抗血清。

注意：根据抗血清的数量和重复次数，可灵活设置孔板：（1）血清稀释可在行或列方向上进行（图2），每种血清应占据独立的行或列。（2）血清稀释的梯度可灵活设定，但应从孔板左上角开始，即从最高血清浓度开始。（3）重复次数需与抗血清数量相平衡，增加重复次数有助于减少实验变异。（4）病毒对照（VC）和细胞对照（CC）的重复次数可灵活设置，但也应分别占据独立的行或列。通常VC的重复次数应显著多于抗血清的重复次数。

1. 提前 2 至 3 天按照步骤 1.1–1.3 准备细胞单层。
2. 向板的每个孔中加入 50 µl VGM。
3. 分别使用第 11 列和第 12 列作为 VC 和 CC。将经 1:20 稀释的受体破坏酶（RDE）处理的血清各 50 µl 加入第 1–10 列的第一行（A 行）。
   注意：每种病毒与血清组合均设两个复孔，因此一块板可例如用于一种病毒与五种抗血清的检测。
4. 通过将 50 µl 从 A 行转移至 H 行（图 2 中的第 1–10 列）进行 2 倍系列稀释，并从 H 行弃去 50 µl。
5. 向 CC 列（图 2 中的第 12 列）每个孔中加入 50 µl 稀释液。
6. 除 CC 列外（图 2 中的第 1–11 列，A–H 行），向板中每个孔加入 50 µl 病毒液。
7. 在 37 °C 下孵育 2–3 小时。移除接种物，向每个孔中加入覆盖层（200 µl），在 37 °C 下静置过夜孵育。随后按照病毒滴定步骤（1.11–1.22）对板进行固定和染色。

3. 中和作用定量分析

1. 将一块孔板放置在平板扫描仪的扫描区域内，如图2a所示。使用L形定位限位装置，以确保成像位置最佳且可重复。
   注意：一次扫描中可同时成像两块孔板。
2. 扫描孔板。
3. 运行“孔板读取器”（Wellplate Reader）软件以计算所需的病毒滴度（图3）。
   1. 点击“加载图像”（Load image）按钮以载入图像。在“全局阈值”（Global Threshold）中滑动红色滑块以调整采样阈值。点击“更新”（Update）按钮以查看调整效果。
   2. 勾选“计算中和/滴定”（Calculate Neutralization/Titration）选项框。点击“采样”（Sampling）按钮以定量ICP。当系统提示时，点击“保存”（Save）按钮以保存采样结果。
      注意：若已勾选“计算中和/滴定”选项框，则在完成采样过程后，将自动弹出一个名为“中和与滴定计算”（Neutralization & Titration Calculation）的新窗口。
   3. 加载或输入孔板图谱。在“中和：感染抑制率（%）”（Neutralization: Infection Deduction (%)）中注明阈值（例如，50%）。
   4. 选择“中和过程”（Neutralization Process）以计算滴度。核对滴度后，点击“保存并关闭”（Save & Close）按钮以保存中和结果。
      注意：中和效价以血清最高稀释倍数的倒数表示，该稀释倍数可使ICP相对于病毒对照组（VC，即图4中第11列的平均值）达到预设的抑制水平（如50%或80%）。代表性结果中采用了50%的ICP抑制率。

结果

图1： 病毒滴定实验中微量板设置的示例。测试病毒被分配至不同的行（A至H），各列用于不同的病毒稀释度（1至12），每种病毒稀释度使用两列作为重复。比例尺 = 10 mm。

图 2： ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
VGM	Sigma	D6429, P0781	500 ml DMEM + 5 ml Pen/Strepb
PBS A			中性 pH 磷酸盐缓冲液：NaCl 10 g，KCl 0.25 g，Na2HPO4 1.437 g，KH2PO4 0.25 g，蒸馏水 1 L
Avicell	FMC	RC-581F	2.4 g 溶于 100 ml 蒸馏水中，磁力搅拌器上搅拌 1 小时至溶解。高压灭菌后使用
2x DMEM	Gibco	21935-028
胰蛋白酶（Trypsin）	Sigma	T1426
覆盖液（Overlay，10 ml/孔板）：			5 ml 2x DMEM，胰蛋白酶终浓度为 2 μg/ml，Avicell 5 ml
Triton X-100 e	Sigma	T8787	通透缓冲液：PBS A 中含 0.2% Triton X-100（v/v）
Tween 80	Sigma	P5188	洗涤缓冲液：PBS A 中含 0.05% Tween 80（v/v）
马血清	PAA Labs Ltd	B15-021	ELISA 缓冲液：PBS A 中含 10% 马血清（v/v）及 0.1% Tween 80
抗甲型流感病毒小鼠单克隆抗体（Mouse MAb against influenza type A）	Biorad	MCA 400	一抗：ELISA 缓冲液中 1:1,000 稀释
辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG（H+L）（Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate）	Biorad	172-1011	二抗：ELISA 缓冲液中 1:1,000 稀释
True Blue 过氧化物酶底物（True Blu peroxidase substrate）	KPL	50-78-02	底物溶液：True Blue 加 0.03% H2O2 g（30% 溶液 1:1,000 稀释）
96 孔平底微孔板	Costar	3596
8 通道多孔板洗板机及分配头	Sigma	M2656
Perfection Plate 扫描仪	Epson	V750 Pro	成像软件可从 http://www.epson.com/cgi-bin/ Store/support/supDetail.jsp? oid=66134&infoType=Downloads 免费下载。
软件运行环境：LabVIEW	National Instruments Corporation	基于 Windows 系统，配备 NI Vision Builder	版本：LabVIEW 2012 或更高版本