使用基于图像的微量中和测定分析病毒之间的抗原关系

Abstract

来源:Lin， Y. 等人 定量微量中和测定的优化。J. Vis. Exp. （2016 年）

该视频演示了基于成像的微中和测定，以分析甲型和乙型流感病毒之间的抗原关系。它提供了一种定量和可视化的方法来评估抗体或其他治疗在预防病毒感染方面的有效性。

Protocol

1. 病毒滴定

注意:根据病毒的数量和重复的数量，可以设置具有以下灵活性的孔板:（1） 病毒稀释液可以沿行或列排列（图 1）。每个病毒都应占据单独的行/列。（2） 病毒稀释增量是灵活的，但应从左上角的最高病毒浓度开始。（3） 重复数量没有限制。

1. 将足够的 MDCK 细胞或 MDCK-SIAT 细胞8 分装到 96 孔板（200 μl/孔）中。将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 2 或 3 天以达到汇合。在补充有 10% 热灭活胎牛血清 （FCS） 和抗生素（100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）的 DMEM 中繁殖细胞。将 SIAT 细胞在 37 °C 下用 5% CO₂ 和 1 mg/ml G418 硫酸盐孵育><。 注意:稀释因子取决于经验和所使用的细胞系。在病毒接种时，细胞单层必须汇合（即，MDCK 细胞没有细胞壁或可见轮廓，MDCK-SIAT1 细胞布局紧密）。表 1 给出了基于 MDCK 或 MDCK-SIAT1 细胞汇合瓶传代培养的稀释实例。
2. 每孔用 200 μl 病毒生长培养基 （VGM） 洗涤细胞 3 次。用 70% EtOH 对多壁洗板机消毒 30 分钟，然后在洗涤前用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或 VGM 冲洗。
3. 吸出 VGM 并立即向每个孔中加入 50 μl VGM。
4. 向 6 个无菌试管中的每一个中加入 900 μl VGM（或更少，取决于测试病毒和重复的数量）。将 100 μl 病毒移液到第一管中，充分混合，然后连续稀释，在每次稀释之间更换吸头。对要滴定的每种病毒重复上述步骤。
   注意: 这将使病毒稀释度为 ^10-1 到 ^10-6。
5. 从 96 孔板的重复孔（图 1 中的 1 x ^10-5）开始，将 50 μl 每种病毒稀释液加入到 96 孔板的重复孔（图 1 中的第 9 列和第 10 列）中。
6. 将板置于 37 °C 下 2-3 小时，让病毒感染细胞><。 注意:需要 2 到 3 小时的潜伏期，以确保接种物中的病毒有足够的时间到达单层病毒。
7. 准备覆盖层（10 ml/板）
   注意:覆盖层由 5 ml 2x DMEM、胰蛋白酶（终浓度 2 μg/ml）、20 μl 1 mg/ml 原液和 5 ml 纤维素棉短绒组成（参见材料列表）。
8. 去除接种物。
9. 添加覆盖层（每个孔 200 μl）。在 37 °C 下孵育过夜，不受干扰。
   注意:病毒出芽发生在大约 4 小时后，因此在此之后板不受干扰非常重要。
10. 从孔中吸出覆盖层。
11. 在 PBS A 中加入冰冷的 4% 多聚甲醛（200 μl/孔）。将它们在 4 °C 下放置 30 分钟或在室温下放置 20 分钟
    注:PBS A 是天然 pH 磷酸盐缓冲盐水，含有 10 g NaCl、0.25 g KCl、1.437 g Na₂HPO₄、0.25 g KH₂PO₄ 和 1 L 蒸馏水（参见材料清单><）。 注意:多聚甲醛吸入有害，吞咽会导致灼伤。有致癌作用的证据也很有限，皮肤接触后可能会引起过敏。
12. 吸出多聚甲醛并用 PBS A（200 μl/孔）洗涤板两次。
13. 将板储存在 4 °C 的 PBS A 中以备将来使用，或继续执行以下步骤。
14. 添加透化缓冲液 （100 μl/孔）。在室温下放置 30 分钟。
15. 用 PBS A（200 μl/孔）洗涤板两次。
16. 每孔加入 50 μl 第一抗体，抗 A 型流感的小鼠 MAb（ELISA 缓冲液中 1:1,000）。在室温下孵育 1 小时（或 4 °C 过夜），同时振荡。
17. 每孔在 100 μl 洗涤缓冲液（PBS A 中的 0.05% 吐温 80，v/v）中洗涤 3 次。在两次洗涤之间在室温下孵育 5 分钟。或者，每孔使用 300 μl 洗涤 3 次而不孵育。
18. 每孔加入 50 μl 第二抗体，山羊抗小鼠 IgG （H+L） HRP 偶联物（ELISA 缓冲液中 1:1,000）。在室温下摇动孵育 1 小时。
19. 按照步骤 1.17 中的说明洗涤 3 次。
20. 添加底物 （50 μl/孔）。在室温下孵育 30 分钟或直到清晰可见蓝色。
21. 为了终止反应，每孔用 200 μl 蒸馏水洗涤板两次，在两次洗涤之间在室温下孵育 2 -3 分钟。
22. 风干板并将其存放在黑暗的地方（例如，用铝箔包裹）。

2. 病毒中和

注意:计算中和测定所需的板数。每个板可容纳一种病毒和多种抗血清。

注意:根据抗血清的数量和重复的数量，可以设置具有以下灵活性的孔板:（1） 血清稀释液可以沿行或列排列（图 2）。每种血清应占据单独的行或列。（2） 血清稀释的增量是灵活的，但应从板左上角的最高血清浓度开始。（3） 重复的数量平衡了 antisera 的数量。更多的重复项有助于消除实验性的变化。（4） VC 的编号和单元格对照 （CC） 重复项的编号是灵活的，但它们也应位于单独的行或列中。预计 VC 重复的数量明显大于 antisera 的数量。

1. 如步骤 1.1-1.3 所示，提前 2 或 3 天准备细胞单层。
2. 向板的每个孔中加入 50 μl VGM。
3. 分别对 VC 和 CC 使用第 11 列和第 12 列。将 50 μl 等分试样的 1:20 受体破坏酶 （RDE） 处理的血清加入第 1-10.
   列的第一行 （A） 中 注意:对于每种病毒和血清组合，检测一式两份进行，因此一个板可能包含一种病毒，例如，针对五种抗血清进行测试。
4. 通过将 50 μl 从 A 行转移到 H 行（图 2 中的第 1-10 列）并从 H 行丢弃 50 μl 来执行 2 倍连续稀释。
5. 向 CC 柱的每个孔中加入 50 μl 稀释剂（图 2 中的第 12 列）。
6. 向板的每个孔中加入 50 μl 病毒，但 CC 柱除外（图 2 中的第 1-11 列，第 A-H 行）。
7. 在 37 °C 下孵育 2-3 小时。取出接种物。向每个孔中加入覆盖层 （200 μl）。在 37 °C 下孵育过夜，不受干扰。按照病毒滴定（步骤 1.11-1.22）固定并染色板。

3. 中和量化

1. 将孔板放置在平板扫描仪的扫描区域，如图 2a 所示。使用 L 形位置限制可确保最佳且可重复的成像位置。
   注意:可以在一次扫描中对两个孔板进行成像。
2. 扫描板。
3. 运行"Wellplate Reader"软件以计算所需的病毒滴度（图 3）。
   1. 单击 "Load image" 按钮以加载图像。滑动 "Global Threshold" 中的红色条以调整采样阈值。点击 "Update" 按钮检查效果。
   2. 勾选"计算中和/滴定"框。单击 "Sampling" 按钮以量化 ICP。出现提示时，单击"保存"按钮以保存采样结果。
      注意:采样过程结束后，如果勾选了"计算中和/滴定"框，将自动出现一个名为"中和和滴定计算"的新窗口。
   3. 加载或输入孔板图。在"Neutralization: Infection Deduction （%）"中指明阈值（例如，50%）。
   4. 选择 "Neutralization Process" （中和过程） 以计算滴度。检查滴度并点击"保存并关闭"按钮以保存中和结果。
      注意:中和报告为血清的最高稀释度与预定义的 ICP 减少（例如 50% 或 80%）与 VC（图 4 中第 11 列的平均值）的倒数。代表性结果中使用了 50% 的 ICP 减少。

Results

图 1:病毒滴定实验中的孔板设置示例。测试病毒被分配到单独的行（A 到 H）。色谱柱设计用于不同的病毒稀释度（1 至 12）。每个病毒稀释度使用两根柱作为副本。比例尺 = 10 毫米。

图 2:样品扫描系统的示意图。（a） 平板扫描仪成像位置上的 96 孔板和 （b） （a） 所示的 L 形位置限制尺寸。

Materials