量化哺乳动物细胞中的大分子自噬捕获活性

摘要

来源：Luhr, M. 等，乳酸脱氢酶隔离检测——一种简单可靠的测定哺乳动物细胞中大自噬隔离活性的方法。J. Vis. Exp. (2018)

该视频展示了一种用于评估哺乳动物细胞中大规模自噬捕获活性的实验方法。该方法利用电穿孔释放细胞质蛋白，包括乳酸脱氢酶（LDH）。通过测定被包裹的LDH和细胞总LDH的比例，评估LDH的捕获情况，从而反映整体的大规模自噬捕获活性。

方案

1. 细胞接种与处理

1. 在75 cm²培养瓶中培养贴壁细胞² 含5% CO₂的湿润化培养箱中的组织培养瓶₂ 在37 °C下，使用相应细胞类型所偏好的培养基进行培养。让细胞生长至接近汇合的单层状态。        
   注意： 使用添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基培养LNCaP、HEK293、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、BJ、MCF-7和RPE-1细胞。
   1. 用 3 mL 洗涤细胞 37 °C 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4。用 3 mL PBS 替换原有溶液 0.25% (w/v) 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），将培养瓶置于含5% CO₂的湿润化培养箱中孵育₂ 37 °C 下孵育，直至细胞脱落（2–5 分钟）。
   2. 用 7 mL 悬浮液重悬细胞 含10% FBS的培养基。取10 µL细胞悬液与10 µL 0.4%台盼蓝混合于微量离心管中，使用0.5–20 µL移液器吸头。用同一吸头立即加样至细胞计数板，然后在自动细胞计数仪中进行细胞计数。
2. 使用含10% FBS的培养基对步骤1.1.2中的细胞悬液进行适当稀释（见下文注释），并接种1 mL 稀释后的细胞悬液加入至 12 孔组织培养....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 和 2 ml 微量离心管	Eppendorf	211-2130 和 211-2120
12 孔板	Falcon	353043
Accumax 细胞解离溶液	Innovative Cell Technologies	A7089	分装后于 -20 °C 可保存数年，冰箱中可保存数月
Bafilomycin A1	Enzo	BML-CM110-0100	溶于 DMSO
BJ 细胞	ATCC	CRL-2522	使用代数 <30
牛血清白蛋白 (BSA)	VWR	422361V
Burker 计数室	Fisher Scientific	139-658585
Countess 细胞计数板	ThermoFisher Scientfic	C10228
Countess II 全自动细胞计数仪	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Burker 计数室盖玻片	Fisher Scientific	139-658586
Criterion Tris-HCl 凝胶，4–20%，26 孔，15 µl，13.3 x 8.7 cm (宽 x 长)	Bio-Rad	3450034
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Earle's 平衡盐溶液 (EBSS)	Gibco	24010-043	含 0.1% 葡萄糖
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
电穿孔比色皿 (4 mm)	Bio-Rad	1652088
指数衰减波电穿孔仪	BTX Harvard Apparatus	EMC 630
胎牛血清 (FBS)	Sigma	F7524	在 RPMI 1640 培养基中终浓度为 10%
HEK293 细胞	ATCC	CRL-1573
咪唑	Sigma-Aldrich	56750	将 65 mM 溶液高压灭菌，冰箱中可保存数月
培养箱；Autoflow IR 直接加热 CO2 培养箱	NuAire	NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂	ThermoFisher	13778150
LNCaP 细胞	ATCC	CRL-1740	使用代数 <30
3-甲基腺嘌呤 (3MA)	Sigma-Aldrich	M9281	在 RPMI 中配制成 100 mM 储存液，-20 °C 保存。  使用前 65 °C 加热 10 分钟，工作浓度为 10 mM
制冷微量离心机	Beckman Coulter Life Sciences	368831
带软模式功能的制冷微量离心机	Eppendorf	Eppendorf 5417R
MRT67307 盐酸盐 (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	抑制 ULK 激酶活性。溶于 DMSO。
MaxMat 多功能分析仪	Erba Diagnostics	PL-II
MCF7 细胞	ATCC	HTB-22
NADH	Merck-Millipore	1.24644.001
Nycodenz	Axis-Shield	1002424
Opti-MEM 低血清培养基	ThermoFisher	31985062
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco	20012-019
移液器吸头 3 (0.5–20 µl)	VWR	732-2223	Thermo Fischer ART 防污染吸头
移液器吸头 (1–200 µl)	VWR	732-2207	Thermo Fischer ART 防污染吸头
移液器吸头 (100–1000 µl)	VWR	732-2355	Thermo Fischer ART 防污染吸头
移液器	ThermoFisher	4701070	Finnpipette F2 GLP 套件
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	用无菌 H2O 配制成 1 mg/ml 储存液。该溶液在 -20 °C 至少可稳定保存 1 年。
丙酮酸	Merck-Millipore	1066190050
RPE-1 细胞 (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	21875-037
SAR-405	ApexBio	A8883	抑制 III 型磷脂酰肌醇 3-激酶 (PIK3C3)。溶于 DMSO。
Silencer Select 阴性对照 #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
Silencer Select ATG9 靶向 siRNA (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	s35504
Silencer Select FIP200 靶向 siRNA (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	s18995
Silencer Select ULK1 靶向 siRNA (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	s15964
Silencer Select ULK2 靶向 siRNA (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	s18705
Silencer Select GABARAP 靶向 siRNA (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	s22362
Silencer Select GABARAPL1 靶向 siRNA (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	s24333
Silencer Select GABARAPL2 靶向 siRNA (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	s22387
磷酸二氢钠二水合物 (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Millipore	1.06580.1000
磷酸氢二钠二水合物 (Na2HPO4 • 2H2O )	Prolabo	28014.291
蔗糖	VWR	443816T	水中终浓度为 10%；经 0.45 µm 滤器过滤，冰箱中可保存数月
毒胡萝卜素	Sigma-Aldrich	T9033	抑制内质网 Ca2+ SERCA 泵。溶于 DMSO。
Triton X-405	Sigma-Aldrich	X405	终浓度 1%
台盼蓝染色液 0.4%	Molecular Probes	T10282
胰蛋白酶-EDTA (0.25% w/v 胰蛋白酶)	Gibco	25200-056
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287	终浓度 0.01%