量化哺乳动物细胞中的大分子自噬捕获活性

摘要

来源：Luhr, M. 等，乳酸脱氢酶隔离检测——一种简单可靠的测定哺乳动物细胞中大自噬隔离活性的方法。J. Vis. Exp. (2018)

该视频展示了一种用于评估哺乳动物细胞中大规模自噬捕获活性的实验方法。该方法利用电穿孔释放细胞质蛋白，包括乳酸脱氢酶（LDH）。通过测定被包裹的LDH和细胞总LDH的比例，评估LDH的捕获情况，从而反映整体的大规模自噬捕获活性。

方案

1. 细胞接种与处理

1. 在75 cm²培养瓶中培养贴壁细胞² 含5% CO₂的湿润化培养箱中的组织培养瓶₂ 在37 °C下，使用相应细胞类型所偏好的培养基进行培养。让细胞生长至接近汇合的单层状态。        
   注意： 使用添加10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基培养LNCaP、HEK293、小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、BJ、MCF-7和RPE-1细胞。
   1. 用 3 mL 洗涤细胞 37 °C 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4。用 3 mL PBS 替换原有溶液 0.25% (w/v) 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），将培养瓶置于含5% CO₂的湿润化培养箱中孵育₂ 37 °C 下孵育，直至细胞脱落（2–5 分钟）。
   2. 用 7 mL 悬浮液重悬细胞 含10% FBS的培养基。取10 µL细胞悬液与10 µL 0.4%台盼蓝混合于微量离心管中，使用0.5–20 µL移液器吸头。用同一吸头立即加样至细胞计数板，然后在自动细胞计数仪中进行细胞计数。
2. 使用含10% FBS的培养基对步骤1.1.2中的细胞悬液进行适当稀释（见下文注释），并接种1 mL 稀释后的细胞悬液加入至 12 孔组织培养板的每孔中（表面积约 3.8 cm²）采用无菌技术操作。置于含5% CO₂的加湿培养箱中培养。₂ 在37 °C下培养至达到所需细胞密度， 例如， 收获时细胞融合度为60–90%。         
   注意： 收获时获得理想细胞汇合度所需的细胞悬液稀释比例因细胞类型以及实验处理的持续时间和类型而异，因此必须针对每种情况通过实验经验确定。
   1. 对于需要在接种后2天进行处理和收获的实验，接种2.5 x 10⁵ LNCaP HEK293 或 MCF-7 细胞，5 × 10⁴ MEFs，4 x 10⁵ BJ，或 1.5 × 10⁵ RPE-1 12孔板中每孔的细胞。
   2. 对于贴壁较松的细胞，应使用针对特定细胞类型推荐的包被物对培养板进行包被。对于LNCaP（及HEK293）细胞，使用聚-D-赖氨酸（PDL）包被的培养板。
   3. 为此，将500 µL浓度为2.5 µg/mL的PDL加入无菌H₂向每个孔中加入 O，将培养板置于无菌环境中，室温（20–25 °C）孵育 30 分钟。用抽吸法去除 PDL，并用 1 mL 无菌 H 每孔短暂洗涤一次₂O.       
      注意： 通常，步骤1.2.1不进行任何实验处理。然而，若进行RNA干扰实验，可在铺板时同步开始反向转染。
3. 每种条件下的实验处理需设置复孔或三孔。
   1. 例如，用50 nM的mTOR抑制剂Torin1处理细胞，该抑制剂通常可有效诱导自噬性包封；或者通过用1 mL无氨基酸的Earle's平衡盐溶液（EBSS）洗涤细胞，使细胞经历急性血清和氨基酸饥饿处理，随后将细胞置于1 mL EBSS中，在含5%二氧化碳（CO₂）的湿润培养箱中孵育。₂在 37 °C 下。
   2. 留出一组孔不作处理，以确定可沉淀乳酸脱氢酶（LDH）的背景水平。
   3. 加入过量的吸附后抑制剂巴佛洛霉素 A1（Baf） 在收获细胞前3–4小时，在无或有实验处理的条件下，将细胞置于含5% CO₂的湿润培养箱中孵育。₂ 在 37 °C。
      1. LNCaP、HEK293、BJ、MCF-7 和 RPE-1 细胞使用 100 nM Baf，MEF 细胞使用 10 nM Baf。
      2. 对于实验处理 持续时间仅为3–4小时（如步骤1.3.1中示例所示）的实验处理，应在开始处理的同时加入Baf。对于持续时间较长的实验处理，应在收获前3–4小时加入2 µL 将500倍浓缩的Baf储备液直接加入培养基中。
      3. 加入Baf后立即通过振荡混匀培养板。此时，也建议加入大自噬封存抑制剂作为对照， 例如， 10 mM 的广谱磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA），或 10 µM 的选择性PI3K III类抑制剂SAR-405。

2. 细胞收获与电破碎前处理

1. 治疗期结束时，用吸液装置吸除培养基，每孔加入 200 µL 细胞解离液（预热至 37 °C）。在 37 °C 下孵育至细胞脱落（通常约 5 分钟）。
   注意：可使用 0.25%（w/v）胰蛋白酶-EDTA 替代细胞解离液，但后者含有 DNase，有助于降低解离后细胞的黏度。只要将培养基彻底吸除，则在加入胰蛋白酶-EDTA 或细胞解离液前无需洗涤细胞。
2. 每孔加入 500 µL 室温（20–25 °C）、pH 7.4 的 PBS，其中含 2%（w/v）牛血清白蛋白（BSA），用移液器吹打重悬细胞，直至无可见细胞团块。立即将细胞悬液转移至预冷的 1.5 mL 微量离心管中，置于冰上。
   注意：除非另有说明，后续所有操作均需在冰上进行。
3. 在 4 °C 下以 400 x g  离心 5 分钟，使细胞沉淀。
4. 用吸液装置彻底吸除上清液，尽量使细胞沉淀保持干燥。
5. 每管加入 400 µL 10%（w/v）蔗糖溶液（溶于超纯 H₂O 中）。

3. 质膜电穿孔及可沉淀细胞组分与全细胞组分的分离

1. 使用移液器重悬细胞沉淀，以获得接近单细胞的悬浮液，并将其转移至4 mm电穿孔比色皿中。         
   注意：通常使用100–1,000 µL移液器枪头上下吹打约10–15次即可。
2. 将比色皿放入指数衰减波电穿孔仪中，在800 V、25 µF和400 Ω条件下放电一次单电脉冲；这些参数可产生约8 ms持续时间的脉冲。
3. 使用新的移液器枪头将细胞裂解物转移至含有400 µL预冷磷酸盐缓冲蔗糖溶液（100 mM 单磷酸钠、2 mM 二硫苏糖醇（DTT）、2 mM EDTA 和1.75%蔗糖，pH 7.5）的1.5 mL微量离心管中，并通过移液短暂混匀。
   1. 可选：为验证质膜电穿孔效率，取步骤3.3中稀释后的细胞裂解物10 µL，与10 µL 0.4%台盼蓝在1.5 mL微量离心管中混合。转移至计数室，确认台盼蓝阳性细胞比例>99%。
      1. 将样品在室温（20–25 °C）下静置30分钟，确认台盼蓝阳性细胞比例仍保持>99%。
   2. 可选：为验证电穿孔未过度剧烈（即未破坏细胞内细胞器），按上述步骤1.1–3.3操作，但使用更大的起始材料（如6孔板中约80%汇合度的一个孔），并在步骤2.5中使用150 µL 10%蔗糖，在步骤3.3中使用150 µL不含DTT的磷酸盐缓冲蔗糖溶液。
      1. 使用移液器小心地将200 µL稀释后的细胞裂解物溶液叠加在2 mL离心管中1.2 mL磷酸盐缓冲8%（w/v）密度梯度介质（例如，8% Nycodenz、50 mM 磷酸钠、2.2%蔗糖、1 mM EDTA）的密度垫上。在4 °C下，以20,000 x g 离心45分钟（使用具有软模式功能的微量离心机，实现温和加速和减速），然后小心将离心管置于冰上。
      2. 小心移除约200 µL上层液体中的60 µL，确保不吸取任何密度梯度介质溶液，并转移至新的微量离心管中。        
         注意：此部分应含有极高纯度的胞质溶胶，称为“细胞汁”。
      3. 使用标准技术及4–20%梯度凝胶，通过蛋白质印迹分析细胞器特异性蛋白，检测上述步骤所得组分的纯度。
      4. 例如，分别对组织蛋白酶B、细胞色素c和蛋白质二硫键异构酶进行免疫印迹，以验证步骤3.2中的电击未破坏溶酶体、线粒体或内质网；同时对乳酸脱氢酶（LDH）进行免疫印迹，以确认细胞汁中存在胞质蛋白。
      5. 同时，对来自总细胞裂解物溶液的蛋白提取物进行免疫印迹分析 ，以确认所用抗体能够检测所评估的细胞器内蛋白。
4. 对每个样品重复步骤3.1–3.3。
5. 从每个稀释后的细胞裂解物溶液（步骤3.3所得）中取出550 µL，加入含有900 µL预冷重悬缓冲液（50 mM 单磷酸钠、1 mM DTT、1 mM EDTA 和5.9%蔗糖，pH 7.5）并补充0.5% BSA和0.01% Tween-20的2 mL微量离心管中，并通过移液短暂混匀。
6. 在4 °C下以18,000 x g 离心45分钟，获得含“沉淀LDH”的沉淀。彻底吸除上清液（使用抽吸法），使沉淀尽可能干燥。将样品置于-80 °C冰箱中保存。
7. 从每个稀释后的细胞裂解物溶液（步骤3.3所得）中转移150 µL至新管中，并将样品置于-80 °C冰箱中保存。这些样品用于测定细胞中的“总LDH”水平。   
   注意：此时实验可暂停任意长时间。

4. 乳酸脱氢酶的提取及酶活性测定

1. 将“沉淀的LDH”（来自步骤3.6）和“总LDH”样本（来自步骤3.7）在冰上解冻。
2. 向“总LDH”样品中加入300 µL含1.5% Triton X-405的预冷重悬缓冲液（最终Triton X-405浓度为1%）。将样品置于4–8 °C冷室中，在旋转仪上孵育30 min。
3. 向“沉淀的LDH”样品中加入750 µL预冷的含1% Triton X-405的重悬缓冲液，用移液器重悬沉淀，直至形成均一溶液。
4. 将4.2和4.3步骤中的样品在18,000 x g 4 °C下，5分钟 以沉淀未溶解的细胞碎片。
5. 将4份冷的65 mM咪唑（pH 7.5）/0.75 mM丙酮酸与1份冷的65 mM咪唑（pH 7.5）/1.8 mM NADH混合，得到工作液，该溶液在4 °C下至少可稳定保存三周。
6. 将第4.4步上清液的3–30 µL与第4.5步工作液200 µL混合。
7. 通过测定乳酸脱氢酶（LDH）催化活性引起的340 nm波长下还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）吸光度在37 °C的下降程度，并与已知LDH浓度的标准品比较，确定LDH的含量。进行吸光度测定 直至反应接近完成， 即 直到340 nm处的吸光度不再随时间变化。 
   注意： 这是一种用于测定乳酸脱氢酶（LDH）活性的经典生化方法。尽管本实验方案在37 °C下进行反应，但也可在室温（20–25 °C）下进行，若采用手动分光光度法测定，则建议使用室温条件。本方案使用 robotic multi-analyzer 仪器，该仪器可自动将样本与工作液混合于96孔板中，并在37 °C下每隔20秒测定一次340 nm处的吸光度，持续3分钟。随后，仪器软件通过比较吸光度随时间变化的斜率与标准曲线，计算出LDH浓度，结果以单位（U）/L表示。 使用已知LDH浓度的标准品进行校准。该方法的线性检测范围为30–1,500 U/L。此外，市面上还存在多种可用于检测LDH的商业试剂盒。其中一些试剂盒基于将酶促反应与比色或荧光产物的生成相偶联，从而实现除紫外分光光度法以外的检测方式，并具有不同的线性检测范围。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 ml 和 2 ml 微量离心管	Eppendorf	211-2130 和 211-2120
12 孔板	Falcon	353043
Accumax 细胞解离溶液	Innovative Cell Technologies	A7089	分装后于 -20 °C 可保存数年，冰箱中可保存数月
Bafilomycin A1	Enzo	BML-CM110-0100	溶于 DMSO
BJ 细胞	ATCC	CRL-2522	使用代数 <30
牛血清白蛋白 (BSA)	VWR	422361V
Burker 计数室	Fisher Scientific	139-658585
Countess 细胞计数板	ThermoFisher Scientfic	C10228
Countess II 全自动细胞计数仪	ThermoFisher Scientfic	AMQAX1000
Burker 计数室盖玻片	Fisher Scientific	139-658586
Criterion Tris-HCl 凝胶，4–20%，26 孔，15 µl，13.3 x 8.7 cm (宽 x 长)	Bio-Rad	3450034
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
Earle's 平衡盐溶液 (EBSS)	Gibco	24010-043	含 0.1% 葡萄糖
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
电穿孔比色皿 (4 mm)	Bio-Rad	1652088
指数衰减波电穿孔仪	BTX Harvard Apparatus	EMC 630
胎牛血清 (FBS)	Sigma	F7524	在 RPMI 1640 培养基中终浓度为 10%
HEK293 细胞	ATCC	CRL-1573
咪唑	Sigma-Aldrich	56750	将 65 mM 溶液高压灭菌，冰箱中可保存数月
培养箱；Autoflow IR 直接加热 CO2 培养箱	NuAire	NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX 转染试剂	ThermoFisher	13778150
LNCaP 细胞	ATCC	CRL-1740	使用代数 <30
3-甲基腺嘌呤 (3MA)	Sigma-Aldrich	M9281	在 RPMI 中配制成 100 mM 储存液，-20 °C 保存。  使用前 65 °C 加热 10 分钟，工作浓度为 10 mM
制冷微量离心机	Beckman Coulter Life Sciences	368831
带软模式功能的制冷微量离心机	Eppendorf	Eppendorf 5417R
MRT67307 盐酸盐 (ULKi)	Sigma-Aldrich	SML0702	抑制 ULK 激酶活性。溶于 DMSO。
MaxMat 多功能分析仪	Erba Diagnostics	PL-II
MCF7 细胞	ATCC	HTB-22
NADH	Merck-Millipore	1.24644.001
Nycodenz	Axis-Shield	1002424
Opti-MEM 低血清培养基	ThermoFisher	31985062
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco	20012-019
移液器吸头 3 (0.5–20 µl)	VWR	732-2223	Thermo Fischer ART 防污染吸头
移液器吸头 (1–200 µl)	VWR	732-2207	Thermo Fischer ART 防污染吸头
移液器吸头 (100–1000 µl)	VWR	732-2355	Thermo Fischer ART 防污染吸头
移液器	ThermoFisher	4701070	Finnpipette F2 GLP 套件
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407-10X5MG	用无菌 H2O 配制成 1 mg/ml 储存液。该溶液在 -20 °C 至少可稳定保存 1 年。
丙酮酸	Merck-Millipore	1066190050
RPE-1 细胞 (hTERT RPE-1)	ATCC	CRL-4000
RPMI 1640	Gibco	21875-037
SAR-405	ApexBio	A8883	抑制 III 型磷脂酰肌醇 3-激酶 (PIK3C3)。溶于 DMSO。
Silencer Select 阴性对照 #1 (siCtrl)	ThermoFisher/Ambion	4390843
Silencer Select ATG9 靶向 siRNA (siATG9A)	ThermoFisher/Ambion	s35504
Silencer Select FIP200 靶向 siRNA (siFIP200)	ThermoFisher/Ambion	s18995
Silencer Select ULK1 靶向 siRNA (siULK1)	ThermoFisher/Ambion	s15964
Silencer Select ULK2 靶向 siRNA (siULK2)	ThermoFisher/Ambion	s18705
Silencer Select GABARAP 靶向 siRNA (siGABARAP)	ThermoFisher/Ambion	s22362
Silencer Select GABARAPL1 靶向 siRNA (siGABARAPL1)	ThermoFisher/Ambion	s24333
Silencer Select GABARAPL2 靶向 siRNA (siGABARAPL2)	ThermoFisher/Ambion	s22387
磷酸二氢钠二水合物 (NaH2PO4 • 2H2O)	Merck-Millipore	1.06580.1000
磷酸氢二钠二水合物 (Na2HPO4 • 2H2O )	Prolabo	28014.291
蔗糖	VWR	443816T	水中终浓度为 10%；经 0.45 µm 滤器过滤，冰箱中可保存数月
毒胡萝卜素	Sigma-Aldrich	T9033	抑制内质网 Ca2+ SERCA 泵。溶于 DMSO。
Triton X-405	Sigma-Aldrich	X405	终浓度 1%
台盼蓝染色液 0.4%	Molecular Probes	T10282
胰蛋白酶-EDTA (0.25% w/v 胰蛋白酶)	Gibco	25200-056
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287	终浓度 0.01%