一种用于评估药物对a疗效的检测方法 结核分枝杆菌 感染模型

摘要

来源：Schaaf, K., 等 一种可兼容高通量的检测方法用于评估药物对巨噬细胞传代后病原体的有效性 结核分枝杆菌. 视频实验杂志 (2017)

本视频展示了一种用于评估药物疗效的实验方法 结核分枝杆菌（Mtb） 感染。一个 体外 包含结核分枝杆菌/巨噬细胞聚集体的感染模型被构建，以模拟 体内 感染。在引入适当的抗生素后，测试其疗效 通过 使用刃天青检测法监测细菌在药物浓度递增条件下的存活情况。

方案

1. 表达绿色荧光蛋白的培养条件 M. tuberculosis mc²6206 (Mtb-GFP

注意： 的 M. tuberculosis H37Rv衍生的营养缺陷型菌株mc²6206 (ΔpanCD，ΔleuCD 转化了的 gfp （绿色荧光蛋白）表达质粒 pMN437 在本方案中全程使用。可以替换该质粒 Mtb-GFP 菌株，具有非-gfp 表达野生型菌株，以便研究人员更便捷地获取该菌株。然而 gfp 表达是可取的，以实现对吞噬作用及吞噬体形成的可视化确认 Mtb/巨噬细胞聚集体。用于长期储存时， Mtb-GFP 样品在补充了20%甘油的完全7H9培养基（见步骤1.1）中于-80 °C冻存。

1. 通过在7H9培养基中添加10% Middlebrook OADC（油酸白蛋白葡萄糖催化酶）、0.02% tyloxapol、24 µg/mL D-泛酸、50 µg/mL L-亮氨酸和50 µg/mL Hygromycin B，制备完全的Mtb-GFP培养基（7H9-C）。
2. 解冻一支Mtb-GFP冻存管，加入10 mL 7H9-C培养基至一个30 mL的方形底PETG培养瓶中。
3. 在37 °C条件下，于旋转摇床（50 rpm）中培养。每隔几天测定一次光密度（OD₆₀₀），直至OD₆₀₀达到1.0（约5–8天）。
4. 根据需要进行稀释和传代培养，以维持OD₆₀₀在0.2–1.0之间。
5. 用于感染时，应使用处于对数生长期（OD₆₀₀为0.6–1）的稳定Mtb-GFP培养物。为避免菌体结团，每周在水浴中对Mtb培养瓶进行一次或两次超声处理（130 W；3次，每次5秒脉冲）。

2. THP-1 细胞的培养条件

1. 通过在 RPMI 1640 培养基中添加 10% 热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和 10 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸），配制完全 THP-1 细胞培养基（RPMI-C）。
2. 将细胞置于含 5% CO₂ 的湿润环境中，于 37 °C 培养箱内培养。
3. 每隔一天使用血细胞计数板或流式细胞术对细胞进行计数，并将 THP-1 细胞密度维持在每毫升 0.1 至 0.6 × 10⁶ 个细胞之间。

3. 用于生成的感染方案 Mtb巨噬细胞聚集结构

1. THP-1 细胞准备（每块 96 孔板）​
   1. 将 7 × 10⁶ 个 THP-1 细胞在 250 × g 条件下离心 5 分钟，弃上清，用 7 mL RPMI-C 重悬细胞。
2. Mtb-GFP 的制备​
   1. 使用摇摆转子离心机，在 3,200 × g 条件下离心 2.8 × 10⁸ 个 Mtb-GFP 细菌 5 分钟，离心前根据 OD₆₀₀ 1.0 = 3 × 10⁸ 细菌/mL 的换算关系确定菌液用量。
   2. 用 RPMI-C 洗涤一次，操作同步骤 3.2.1。
   3. 用 7 mL RPMI-C 重悬菌体，并涡旋振荡 10 秒。
3. 感染
   ​注意：参见 图 1 中的实验模板。
   1. 在 96 孔板的 A 和 H 行以及 1 和 12 列中各加入 200 µL 无菌水，形成水封边缘，以防止培养基蒸发。
   2. 在第 2 列（B2 至 G2）中加入 200 µL RPMI-C，作为背景对照（空白组）。
   3. 将 Mtb-GFP 悬液（步骤 3.2）加入 THP-1 细胞悬液（步骤 3.1）中，通过移液充分混匀。最终 THP-1 细胞密度为每毫升 5 × 10⁵ 个，感染复数（MOI）为 40。
   4. 将 THP-1/Mtb-GFP 混合悬液倒入一个 25 mL 的储液槽中。
   5. 使用多通道移液器向其余所有 96 个孔（B3 至 G11）中各加入 200 µL THP-1/Mtb-GFP 悬液。
      注意：若同时处理多块 96 孔板，应定期重新混匀储液槽中剩余的 THP-1/Mtb 悬液，以确保每孔加入的混合物均匀一致。
   6. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 7–10 天。
   7. 每 2 天更换一次培养基：使用多通道移液器缓慢吸去每孔上层 100 µL 废培养基，再轻柔加入 100 µL 预热的 RPMI-C。切勿吹打重悬孔内细胞，以免扰动孔底的 Mtb/巨噬细胞聚集体。
   8. 每天使用荧光显微镜（4–10× 物镜）观察各孔，记录 Mtb/巨噬细胞聚集体的大小。至第 7–10 天时，Mtb/巨噬细胞聚集体应已充分形成（可参考 图 2），可进入药物疗效检测阶段（第 4 节）。
   9. 如需记录，可使用配备明场和 GFP 滤光片组的自动细胞成像系统对全部 96 孔进行图像采集，以记录 Mtb/巨噬细胞聚集体的形成过程。
      注意：若无自动成像系统，也可使用具备 GFP 和明场成像功能的任意合适显微镜拍摄代表性孔位的图像。

4. 生长抑制试验评估药物对源自Mtb/巨噬细胞聚集体的Mtb的抑制效果

1. 药物制备（两种药物，每种三个重复条件）
   注意：参见 图1A 中的模板。
   1. 在另一个96孔板中，向B2至G10孔各加入125 µL 7H9-C培养基。
   2. 将两种药物分别用1 mL 7H9-C培养基配制成目标最高终浓度的两倍浓度，以补偿步骤4.2.4中的稀释效应。
   3. 使用多通道移液器，将每种药物各250 µL分别加入B11-C11-D11和E11-F11-G11孔，用于三个重复处理。
   4. 使用多通道移液器，通过将125 µL液体从B11-G11孔转移至B10-G10孔，对测试药物进行两倍系列稀释。每步吹打混匀5次。
   5. 继续以125 µL为单位，从一列向下一列（从右至左）进行转移，至第4列停止。
   6. 混合第4列后，弃去125 µL至废液容器中。第2列和第3列不应含有任何药物，以便作为空白对照（空白）和阳性生长对照。
      注意：也可参照 图1B 中的模板进行药物文库筛选。每块96孔板可容纳58种药物在单一浓度下的测试。由于该药物板将在步骤4.2.4中被稀释一半，因此应以目标终浓度的两倍浓度进行配制。
2. 药物处理：
   1. 取出含有结核分枝杆菌（Mtb）感染的巨噬细胞（Mtb/巨噬细胞聚集体）的96孔板。
   2. 使用多通道移液器小心吸弃所有相关孔（B2至G11）中的液体。分两步进行：首先不倾斜平板，移除150 µL；然后倾斜平板，将移液枪头插入孔底边缘，吸除剩余液体（约50 µL）。由于Mtb/巨噬细胞聚集体贴附于孔底，不应有细胞损失。
   3. 轻柔地向含有Mtb/巨噬细胞聚集体的平板中所有相关孔（B2至G11）各加入100 µL 7H9-C培养基。
   4. 使用多通道移液器，从含药的96孔板（步骤4.1）中取100 µL液体，加入感染板的对应孔中。
   5. 将平板放入密封袋中，在37 °C条件下孵育3天。

5. 使用刃天青微孔板法量化药物疗效

1. 用 H₂O 配制终浓度为 0.8 mg/mL 的刃天青储备液。使用孔径为 0.22 µm 的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜过滤除菌。
2. 按 2:1:1 的比例混合刃天青储备液、H₂O 和吐温-80（20% 的 H₂O 溶液），配制刃天青工作液。终浓度为 0.4 mg/mL 刃天青和 5% 吐温-80。
3. 使用酶标仪，设置程序在 37 °C 下每 30 分钟读取一次荧光值，激发波长为 530 nm，发射波长为 590 nm，持续 24 小时。提前将酶标仪预热至 37 °C。
4. 使用多通道移液器，向药物处理板（步骤 4.11）的所有相关孔（B2 至 G11）中加入 20 µL 刃天青工作液。
5. 将板放入酶标仪中，并启动步骤 5.3 中设置的程序。
   注意：为便于高通量检测板的处理，也可将检测板置于 37 °C 培养箱中孵育，并每 24 小时进行一次单次荧光读数。此方法同样适用于无法使用具备动力学和孵育功能酶标仪的用户。

结果

图1：药物板布局。（A）步骤4中使用的药物处理板的示例模板。该模板可在8个确定浓度下，对两种药物进行三复孔并行检测。以代表性实验为例，我们分别从2 µM和2.5 µM起始浓度使用利福平（RIF）和莫西沙星（MOXI）。（B）还提供了一种适用于高通量筛选的替代模板，用于展示在单一浓度下同时检测58种化合物的可能性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7H9	BD Difco	271310	遵循制造商的建议
Middlebrook OADC	BD Biosciences	212351
Tyloxapol	Sigma	T8761	用 H2O 配制 20% 储存液；过滤除菌
D-泛酸半钙盐	Sigma	P5710	用 H2O 配制 24 mg/mL 储存液；过滤除菌
L-亮氨酸	MP Biomedicals	194694	用 H2O 配制 50 mg/mL 储存液；过滤除菌
潮霉素B	EMD Millipore	400051	用 H2O 配制 200 mg/mL 储存液
Nalgene 方形 PETG 培养基瓶	Thermo Fisher	2019-0030
RPMI 1640 培养基	Hyclone	SH30027.01
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S12450H
L-谷氨酰胺	Corning	MT25005CI
HEPES	Hyclone	SH30237.01
Cytation 3 酶标仪	Biotek		可与任何荧光酶标仪和显微镜互换使用
Gen5 软件	Biotek		记录和分析刃天青还原反应
利福平	Fisher Scientific	BP2679250	用 H2O 配制 10 mg/mL 储存液
盐酸莫西沙星	Acros Organics	457960010	用 H2O 配制 10 mg/mL 储存液
刃天青钠盐	Sigma	R7017	用 H2O 配制 800 μg/mL 储存液；过滤除菌
吐温-80	Fisher Scientific	T164500	用 H2O 配制 20% 储存液；过滤除菌