一种用于评估药物对a疗效的检测方法 结核分枝杆菌 感染模型

摘要

来源：Schaaf, K., 等 一种可兼容高通量的检测方法用于评估药物对巨噬细胞传代后病原体的有效性 结核分枝杆菌. 视频实验杂志 (2017)

本视频展示了一种用于评估药物疗效的实验方法 结核分枝杆菌（Mtb） 感染。一个 体外 包含结核分枝杆菌/巨噬细胞聚集体的感染模型被构建，以模拟 体内 感染。在引入适当的抗生素后，测试其疗效 通过 使用刃天青检测法监测细菌在药物浓度递增条件下的存活情况。

方案

1. 表达绿色荧光蛋白的培养条件 M. tuberculosis mc²6206 (Mtb-GFP

注意： 的 M. tuberculosis H37Rv衍生的营养缺陷型菌株mc²6206 (ΔpanCD，ΔleuCD 转化了的 gfp （绿色荧光蛋白）表达质粒 pMN437 在本方案中全程使用。可以替换该质粒 Mtb-GFP 菌株，具有非-gfp 表达野生型菌株，以便研究人员更便捷地获取该菌株。然而 gfp 表达是可取的，以实现对吞噬作用及吞噬体形成的可视化确认 Mtb/巨噬细胞聚集体。用于长期储存时， Mtb-GFP 样品在补充了20%甘油的完全7H9培养基（见步骤1.1）中于-80 °C冻存。

1. 通过在7H9培养基中添加10% Middlebrook OADC（油酸白蛋白葡萄糖催化酶）、0.02% tyloxapol、24 µg/mL D-泛酸、50 µg/mL L-亮氨酸和50 µg/mL Hygromycin B，制备完全的Mtb-GFP培养基（7H9-C）。
2. 解冻一支Mtb-GFP冻....

结果

图1：药物板布局。（A）步骤4中使用的药物处理板的示例模板。该模板可在8个确定浓度下，对两种药物进行三复孔并行检测。以代表性实验为例，我们分别从2 µM和2.5 µM起始浓度使用利福平（RIF）和莫西沙星（MOXI）。（B）还提供了一种适用于高通量筛选的替代模板，用于展示在单一浓度下同时检测58种化合物的可能性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7H9	BD Difco	271310	遵循制造商的建议
Middlebrook OADC	BD Biosciences	212351
Tyloxapol	Sigma	T8761	用 H2O 配制 20% 储存液；过滤除菌
D-泛酸半钙盐	Sigma	P5710	用 H2O 配制 24 mg/mL 储存液；过滤除菌
L-亮氨酸	MP Biomedicals	194694	用 H2O 配制 50 mg/mL 储存液；过滤除菌
潮霉素B	EMD Millipore	400051	用 H2O 配制 200 mg/mL 储存液
Nalgene 方形 PETG 培养基瓶	Thermo Fisher	2019-0030
RPMI 1640 培养基	Hyclone	SH30027.01
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S12450H
L-谷氨酰胺	Corning	MT25005CI
HEPES	Hyclone	SH30237.01
Cytation 3 酶标仪	Biotek		可与任何荧光酶标仪和显微镜互换使用
Gen5 软件	Biotek		记录和分析刃天青还原反应
利福平	Fisher Scientific	BP2679250	用 H2O 配制 10 mg/mL 储存液
盐酸莫西沙星	Acros Organics	457960010	用 H2O 配制 10 mg/mL 储存液
刃天青钠盐	Sigma	R7017	用 H2O 配制 800 μg/mL 储存液；过滤除菌
吐温-80	Fisher Scientific	T164500	用 H2O 配制 20% 储存液；过滤除菌