一种用于检测病毒抗体依赖性增强感染的体外实验方法

摘要

来源：Valiant, W. G., 等 一种基于流式细胞术的简易检测方法 体外 利用寨卡病毒恢复期血清增强登革病毒感染的抗体依赖性效应。 视频实验杂志 (2018).

本视频演示了一种利用寨卡病毒恢复期血清检测登革病毒感染的抗体依赖性增强（ADE）的实验方法。该实验采用编码绿色荧光蛋白的登革病毒报告病毒颗粒（RVPs）。针对寨卡病毒的血清抗体与RVPs发生交叉反应，形成复合物。结合的抗体可增强表达Fc受体的细胞对RVPs的摄取，通过流式细胞术检测该过程。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 第1天

注意：在生物安全二级（BSL-2）实验室中用于组织培养的无菌层流生物安全柜内进行以下所有操作。

1. 将血清样本在室温下解冻，并将每份血清样本各100 µL转移至无菌管中。在56°C水浴或可调温的恒温混匀仪中加热灭活30分钟。使用冷的RPMI-10培养基（含10%胎牛血清的RPMI）对血清样本进行10倍系列稀释，稀释范围从1:1至1:1,000。
2. 将系列稀释后的血清样本各10 µL加入到无菌96孔V型底板的每个孔中。设置两组对照孔：一组为仅含RPMI-10和RVPs但不含血清样本的孔，另一组为仅含RPMI-10但不含RVPs和血清样本的孔。每份血清样本及RPMI-10对照均设三个复孔。
3. 从-80 °C冰箱中取出登革病毒1、2、3和4型RVPs，在37 °C水浴中解冻，并立即将解冻后的RVPs置于冰上。每份血清样本需准备约170 µL RVPs（每个血清稀释度（1:1、1:10、1:100、1:1,000）对应3个孔，每孔10 µL RVPs；RPMI-10加RVPs对照组每个孔也需10 µL RVPs，共3个孔）。
4. 用移液器将10 µL RVPs加入含有血清样本的96孔V型底板各孔，以及仅含RPMI-10和RVPs（无血清）的对照孔中。不要向仅含RPMI-10（无血清样本且无RVPs）的孔中加入RVPs。通过上下吹打5–10次充分混匀。在仅含冷RPMI-10（无血清样本且无RVPs）的对照孔中，每孔加入10 µL冷RPMI-10以替代RVPs。
5. 将96孔V型底板转移至培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。在96孔V型底板孵育期间，使用70%乙醇清洁生物安全柜表面，并开启紫外灯照射15分钟。
6. 从培养箱中取出一个完全融合的T75培养瓶K562细胞，用无菌5 mL移液管充分混匀细胞，将5 mL细胞悬液转移至无菌15 mL锥形管中。
   注意： K562细胞维持在RPMI-10培养基中，传代密度为1 × 10⁶/mL。
7. 从无菌15 mL锥形管中取出10 µL细胞悬液，与10 µL台盼蓝混合，使用血细胞计数板计数，以确定15 mL锥形管中的总细胞数。
8. 将含细胞的15 mL锥形管在约1,200 × g条件下离心10分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于预热的RPMI-10培养基中，调整浓度为80,000个细胞/30 µL培养基（即2.66 × 10⁶ 个细胞/mL）。
9. 从培养箱中取出96孔V型底板（步骤1.6），向每孔加入30 µL K562细胞，通过上下吹打5–10次充分混匀。将96孔V型底板放回培养箱，在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育1小时。
10. 孵育1小时后，从培养箱中取出96孔V型底板，在约1,200 × g条件下离心5分钟。离心后，将板倒置放入含10%次氯酸钠溶液的容器中，弃去各孔中的培养基。
11. 通过向每孔加入125 µL预热的RPMI-10培养基重悬细胞，用移液器充分混匀，然后在约1,200 × g条件下离心5分钟。离心后，将板倒置放入含10%次氯酸钠溶液的容器中弃去培养基。重复此洗涤步骤两次。
12. 洗涤完成后，向每孔加入100 µL预热的RPMI-10培养基，用移液器上下吹打混匀，随后将板置于培养箱中，在37 °C、5% CO₂条件下孵育48小时。

2. 第3天

1. 从培养箱中取出含有100 µL细胞及培养基/孔的96孔V型底板，转移至生物安全柜中。使用多通道移液器混匀每孔内容物，并将细胞和培养基转移至96孔U型底板或预先标记的5 mL聚丙烯管中。
2. 用100 µL含1%多聚甲醛（PFA）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗96孔V型底板的每个孔，并将冲洗液转移至步骤2.1中的96孔U型底板对应孔或标记的5 mL聚丙烯管中，使每孔或每管中PFA的终浓度为0.5%。使用多通道移液器充分混匀，用铝箔纸覆盖板子，于培养箱中静置30分钟以固定细胞。
3. 通过运行未染色的K562细胞来校准流式细胞仪（示例参见材料表），调节侧向散射光和前向散射光以及荧光参数设置。仅需使用FL1荧光通道，因为GFP是细胞中唯一发出的荧光。从每个样本中采集约30,000–50,000个细胞。
   注意：任何能够检测单一荧光信号的流式细胞仪均可用于数据采集，因为感染RVPs的细胞仅因表达GFP而发出绿色荧光，无需其他荧光通道。

3. 数据分析

1. 使用任意流式细胞仪分析软件（参见材料表）分析流式细胞仪获取的数据。
   1. 根据FSC-A（前向散射-面积）对FSC-H（前向散射-高度）设置第一个门控，以包含单细胞并从分析中排除自发荧光的双联体。然后，基于SSC-A（侧向散射-面积）对FSC-A对单细胞门控的细胞进行门控，以排除任何自发荧光碎片。
   2. 对经SSC-A与FSC-A门控的细胞，通过SSC-A对GFP-A分析GFP表达情况。通过在GFP+细胞周围设置门控，确定每种血清稀释度及对照样品中GFP+细胞的百分比。
2. 通过将三个重复孔中GFP+细胞总百分比除以3，计算每种血清样品稀释度及对照孔中GFP+细胞的平均百分比。
3. 通过将各稀释度血清样品中GFP+细胞的平均百分比除以RPMI-10加RVPs（无血清样品）对照孔中GFP+细胞的平均百分比，计算感染增强倍数。
4. 绘制增强倍数（y轴）对稀释倍数（x轴）的图表，并使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，随后采用Tukey多重比较事后检验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 细胞	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	含 10% FBS 的 RPMI-10
青霉素-链霉素	MP biomedicals	1670049	每毫升 RPMI-10 中含 100 IU 青霉素、100 µg 链霉素
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025 M RPMI-10
MEM 非必需氨基酸溶液 (100×)	Sigma	M7145	在 RPMI-10 中稀释至 1×
丙酮酸钠	Cellegro	25-000-Cl	1 mM RPMI-10
L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	MT25005CI
无菌 V 型底板	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon 聚丙烯 5 ml FACS 管	VWR	60819-728
非无菌 U 型底板	Falcon	Ref 353910	FACS 管的高通量替代方案
5 mL 无菌刻度移液管	Denville	P7127
200 µL 无菌移液器吸头	Denville	P3020 CPS
20 µL 无菌移液器吸头	Denville	P1121
50–200 µL 多通道移液器	Denville	P3975-8-B
5–50 µL 多通道移液器	Denville	P3975-9-B
20% 甲醛	Tousimis	#1008B
水浴锅	ThermoFisher	TSCOL35
恒温混匀仪	Eppendorf	2231000387	用于热灭活的水浴锅替代设备
CO₂ 培养箱	ThermoFisher	13-998-213
乙醇	Sigma Aldrich	E7023
液体漂白剂	Fisher Scientific	NC9724348
FlowJo 9.8	TreeStar, Inc.		流式细胞术分析软件
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dickinson
BD LSR II 流式细胞仪	Becton Dickinson
液体漂白剂	Fisher Scientific	NC9724348