一种用于检测病毒抗体依赖性增强感染的体外实验方法

摘要

来源：Valiant, W. G., 等 一种基于流式细胞术的简易检测方法 体外 利用寨卡病毒恢复期血清增强登革病毒感染的抗体依赖性效应。 视频实验杂志 (2018).

本视频演示了一种利用寨卡病毒恢复期血清检测登革病毒感染的抗体依赖性增强（ADE）的实验方法。该实验采用编码绿色荧光蛋白的登革病毒报告病毒颗粒（RVPs）。针对寨卡病毒的血清抗体与RVPs发生交叉反应，形成复合物。结合的抗体可增强表达Fc受体的细胞对RVPs的摄取，通过流式细胞术检测该过程。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 第1天

注意：在生物安全二级（BSL-2）实验室中用于组织培养的无菌层流生物安全柜内进行以下所有操作。

1. 将血清样本在室温下解冻，并将每份血清样本各100 µL转移至无菌管中。在56°C水浴或可调温的恒温混匀仪中加热灭活30分钟。使用冷的RPMI-10培养基（含10%胎牛血清的RPMI）对血清样本进行10倍系列稀释，稀释范围从1:1至1:1,000。
2. 将系列稀释后的血清样本各10 µL加入到无菌96孔V型底板的每个孔中。设置两组对照孔：一组为仅含RPMI-10和RVPs但不含血清样本的孔，另一组为仅含RPMI-10但不含RVPs和血清样本的孔。每份血清样本及RPMI-10对照均设三个复孔。
3. 从-80 °C冰箱中取出登革病毒1、2、3和4型RVPs，在37 °C水浴中解冻，并立即将解冻后的RVPs置于冰上。每份血清样本需准备约170 µL RVPs（每个血清稀释度（1:1、1:10、1:100、1:1,000）对应3个孔，每孔10 µL RVPs；RPMI-10加RVPs对照组每个孔也需10 µL RVPs，共3个孔）。
4. 用移液器将10 µL RVPs加入含有血清样本的96孔V型底板各孔，以及仅含RPMI-10和RV....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 细胞	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	含 10% FBS 的 RPMI-10
青霉素-链霉素	MP biomedicals	1670049	每毫升 RPMI-10 中含 100 IU 青霉素、100 µg 链霉素
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	0.025 M RPMI-10
MEM 非必需氨基酸溶液 (100×)	Sigma	M7145	在 RPMI-10 中稀释至 1×
丙酮酸钠	Cellegro	25-000-Cl	1 mM RPMI-10
L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	MT25005CI
无菌 V 型底板	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon 聚丙烯 5 ml FACS 管	VWR	60819-728
非无菌 U 型底板	Falcon	Ref 353910	FACS 管的高通量替代方案
5 mL 无菌刻度移液管	Denville	P7127
200 µL 无菌移液器吸头	Denville	P3020 CPS
20 µL 无菌移液器吸头	Denville	P1121
50–200 µL 多通道移液器	Denville	P3975-8-B
5–50 µL 多通道移液器	Denville	P3975-9-B
20% 甲醛	Tousimis	#1008B
水浴锅	ThermoFisher	TSCOL35
恒温混匀仪	Eppendorf	2231000387	用于热灭活的水浴锅替代设备
CO₂ 培养箱	ThermoFisher	13-998-213
乙醇	Sigma Aldrich	E7023
液体漂白剂	Fisher Scientific	NC9724348
FlowJo 9.8	TreeStar, Inc.		流式细胞术分析软件
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dickinson
BD LSR II 流式细胞仪	Becton Dickinson
液体漂白剂	Fisher Scientific	NC9724348