一种用于筛选抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒的检测方法

摘要

来源：Yang, H.，等。在吞噬性免疫细胞中筛选可抑制Toll样受体信号通路的生物活性纳米颗粒。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频展示了一种基于报告细胞的检测方法，用于筛选可抑制Toll样受体（TLR）信号通路的潜在生物活性纳米颗粒。该检测方法包括将脂多糖（LPS）与肽-金纳米颗粒杂合物混合后加入报告巨噬细胞中，这些细胞表达报告蛋白——分泌型胚胎碱性磷酸酶（SEAP）和荧光素酶。通过检测报告信号的变化，评估杂合物对LPS诱导的TLR信号通路的抑制作用。

方案

1. 利用报告细胞筛选潜在的 TLR4 纳米抑制剂

注意：由于 TLR4 信号通路同时利用 MyD88 依赖性和 TRIF 依赖性两条途径，因此被选为主要靶点，以涵盖广泛的 TLR 信号通路。THP-1-XBlue 报告细胞主要用于检测 NF-κB/AP-1 的活化，而 THP-1-Dual 细胞则用于检测 TRIF 依赖性信号转导中的 IRF 活化。

1. 在筛选前通过生成剂量-反应曲线确定最佳LPS剂量。​
   1. 将工作浓度的LPS溶液用R10培养基稀释至终浓度为0.01–100 ng/mL（按10的对数倍稀释）。设计好板式布局，并在96孔圆底培养板中进行稀释。确保稀释后每孔溶液体积不少于110 μL。
   2. 使用真空抽吸器轻柔地从接种细胞的培养板中移除培养基。
   3. 根据样品布局，将步骤1.1.1中制备的含LPS的R10培养基转移至培养板中。将培养板置于37 °C（细胞培养箱中）孵育24小时。
   4. 孵育24小时后，小心地将各孔上清液（80 μL/孔）转移至新的96孔圆底板中。立即进行比色法和/或荧光素酶发光检测；或在检测前将样品暂时储存在4 °C（数小时）或-20 °C（数天）。
      注意： 板式设计应简洁明了，便于实验操作与数据分析。每种条件应设置2–4个重复。务必包含阴性对照组（不含LPS）。建议使用THP-1-XBlue细胞检测NF-κB/AP-1激活，因为Dual细胞在分化为巨噬细胞后NF-κB/AP-1激活背景值相对较高。然而，Dual细胞也可用于同时报告NF-κB/AP-1和IRF的激活。
2. 开展NF-κB/AP-1激活的比色检测和IRF激活的荧光素酶发光检测。
   1. 为评估NF-κB/AP-1激活，将各样品20 μL上清液转移至新的96孔平底培养板中，每孔加入180 μL预热的SEAP底物溶液。在37 °C孵育1–2小时，使颜色充分显色（由粉红色变为深蓝色）。使用酶标仪在655 nm波长处测定吸光度。
      注意： 孵育时间可根据显色情况调整（可短至30分钟，也可延长至过夜）。建议等待最深颜色的光密度（O.D.）超过1，但避免显色过度饱和（O.D. >3）。
   2. 为分析IRF激活，将各样品10 μL上清液转移至96孔透明平底白色板中，每孔加入50 μL荧光素酶检测试剂，立即逐孔读取发光值。
      注意： 强烈建议使用具备自动加样功能的发光酶标仪，以确保孔间和板间读数的一致性。若手动加入底物，请确保每孔的孵育时间和读数条件保持一致。
3. 在不同肽-GNP杂合物中开展筛选实验，使用10 ng/mL LPS刺激（依据步骤1.1）。报告基因检测的开发流程参照步骤1.2进行。
   1. 采用离心法将肽-GNP杂合物在R10培养基中浓缩至200 nM。将20倍体积的杂合物溶液（10 nM）在18,000 × g下离心30分钟，小心弃去上清液。收集管底的杂合物，用PBS洗涤两次，再将其重悬于原体积的R10培养基中。
   2. 将浓缩后的杂合物与含LPS（20 ng/mL）的R10培养基等体积混合，使杂合物和LPS的终浓度分别为100 nM和10 ng/mL。
   3. 移除培养板中的培养基，每孔加入100 μL混合溶液（每种条件设3个重复）；设置阴性对照（仅培养基）和LPS对照（10 ng/mL LPS，不含杂合物）。
   4. 在37 °C孵育24小时后，将各孔培养液转移至离心管中，在4 °C、18,000 × g条件下离心30分钟。收集上清液（50–80 μL/管）至96孔圆底板中，按步骤3.2所述进行报告基因检测。
      注意： 离心后弃去上清液时，切勿扰动管底的杂合物沉淀。
      注意： 步骤1.3.4中的离心步骤至关重要，可去除未被细胞内化的纳米颗粒杂合物，避免其对比色法或发光检测造成干扰。这是因为金纳米颗粒会根据其尺寸和聚集状态吸收宽范围波长的光。

2. 验证潜在候选物的抑制作用

注意：为验证筛选所得潜在候选物的抑制作用，采用两种方法。一种是固定杂合物浓度（或反之），检测刺激剂（LPS）的剂量反应；另一种是通过免疫印迹直接检测对NF-κB/AP-1和IRF3信号通路的抑制情况。

1. 方法一：按照1.3节所述相同步骤，使用100 nM的先导杂合分子以及两种LPS浓度（1 ng/mL和10 ng/mL）进行报告基因检测。同时设置一种无活性的杂合分子（基于筛选结果）作为杂合分子对照，用于比较。
2. 对于免疫印迹分析，请遵循标准实验流程：
   1. 将THP-1细胞在R10培养基中培养，接种至12孔培养板（每孔2 × 10⁶个细胞），并通过添加50 ng/mL PMA处理24小时诱导其向巨噬细胞分化，随后静置培养2天。
   2. 细胞分化完成后，用10 ng/mL LPS刺激细胞，同时或不同时加入杂合分子（100 nM），刺激时间最长至4小时。在不同时间点（0、5、15、30、60、120和240分钟）收集细胞裂解液用于免疫印迹分析。设置一种无活性的杂合分子作为对照。
   3. 检测IκBα、磷酸化p65和磷酸化IRF3的信号，以评估先导杂合分子对NF-κB和IRF3活化的抑制作用。同时检测β-actin和总IRF3信号作为内参对照。
      注意：信号转导过程通常比报告酶SEAP和荧光素酶的表达（24小时）快得多（数小时内）。强烈建议同时在24小时时间点对测试的杂合分子进行细胞活力检测，作为另一种验证方法。

3. 评估 TLR 特异性

注意：为研究先导肽-GNP 杂合物对 TLR 的特异性，需检测其他 TLR 信号通路，包括 TLR2、TLR3 和 TLR5。TLR7、8 和 9 被排除，因为 THP-1 来源的巨噬细胞对这些 TLR 的刺激反应较差，原因是巨噬细胞不表达 TLR7、8 和 9。

1. 采用1.1和1.2中的相同步骤，测试TLR2特异性配体（Pam3CSK4）、TLR3特异性配体（poly I:C）和TLR5特异性配体（flagellin）在1 ng/mL至25 μg/mL范围内不同浓度对两种报告细胞来源巨噬细胞的作用，以确定最佳浓度。
2. 使用先导杂合分子（100 nM）与3.1中确定浓度的各TLR配体混合物处理细胞，按照1.3中所述实验步骤评估该先导杂合分子的抑制特异性。以无活性的杂合分子作为对照进行比较。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
THP-1-XBlue 报告细胞	InvivoGen	thpx-sp	细胞培养传代次数保持在 20 代以下
THP-1-Dual 报告细胞	InvivoGen	thpd-nfis	细胞培养传代次数保持在 20 代以下
RPMI-1640（不含 L-谷氨酰胺）	GE Health Care	SH30096.02	使用前预热至 37 °C；添加补充剂配制成完全培养基 R10
胎牛血清（经鉴定合格）	Thermo Fisher Scientific	12484028	经热灭活处理；在 RPMI-1640 中终浓度为 10%
L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	在完全培养基 R10 中终浓度为 2 mM
丙酮酸钠	Thermo Fisher Scientific	11360-070	在完全培养基 R10 中终浓度为 1 mM
杜氏磷酸盐缓冲液（1X，不含钙、镁）	GE Health Care	SH30028.02	用于细胞洗涤和试剂配制
QUANTI-Blue	InvivoGen	rep-qb1	SEAP 底物
QUANTI-Luc	InvivoGen	rep-qlc2	荧光素酶底物
Zeocin	InvivoGen	ant-zn-1	报告细胞筛选用抗生素
Blasticidin	InvivoGen	anti-bl-1	报告细胞筛选用抗生素
分子生物学用二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418-100ML	用于试剂配制
来自大肠杆菌 K12 的脂多糖（LPS）	InvivoGen	tlrl-eklps	TLR4 配体
鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）鞭毛蛋白（FLA-ST），超纯	InvivoGen	tlrl-epstfla	TLR5 配体
SpectraMax Plus 384 微孔板读板仪	Molecular Devices	N/A	读取比色法检测信号
Infinite M200 Pro 多功能微孔板读板仪（带注射器）	Tecan	N/A	读取化学发光信号
Costar 检测板，96 孔白色板，透明平底，组织培养处理	Corning Costar	3903	用于化学发光检测