一种用于定量感染小鼠器官中病毒滴度的焦点形成实验

摘要

来源：Brien, J. D. 等，小鼠多种器官中寨卡病毒的分离与定量。J. Vis. Exp. (2019)

视频演示了在多种小鼠器官中定量寨卡病毒的实验方法 通过 空斑形成实验。该过程包括用病毒感染的组织匀浆感染哺乳动物细胞单层，随后使用甲基纤维素以阻止病毒扩散。接着采用免疫染色方法，实现对器官特异性感染能力的精确定量与测定。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 器官分离

注意： 病毒在室温（RT）下不稳定，因此必须合理规划单次采集的动物数量，以保持病毒滴度。

1. 根据所需表型，选择适当的剂量和途径感染小鼠。在本方案中，使用 8–10 周龄的雄性和雌性 I 型干扰素受体缺陷型（Ifnar1−/−）小鼠，通过尾静脉注射途径接种 1 × 10³ PFU 的病毒。^-/-C57BL/6小鼠
   1. 麻醉 Ifnar1^-/- 小鼠以氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物麻醉。通过用力捏压脚趾测试脚掌反射，以确认麻醉效果。给予1 × 10⁵ 皮下注射（SC）50 μL ZIKV 的焦点形成单位（FFU） 通过 足垫
2. 前一天准备好收获所需的全部材料：2 把剪刀、镊子，以及用于工具消毒的 50 mL 锥形瓶中的 20 mL 70% 乙醇（EtOH）。
   1. 准备注射器和针头：用于灌注的20 mL注射器，23 G针头（每笼约1个），以及配有25 G针头的1 mL注射器（每3-5只小鼠1个）。在称量前，于生物安全柜中向每个1.5 mL O型圈螺口管（每个器官一个）中加入钢珠。这些管子需适用于组织匀浆。
3. 在收获当天准备好灌注和器官冷冻所需的材料。
   1. 用干冰和70%乙醇填充冰桶，制备冰浴。准备无菌磷酸盐缓冲液（PBS），假设每只小鼠灌注需要25–30 mL PBS（脊髓需要5–10 mL）。准备麻醉剂，即氯胺酮和赛拉嗪的混合液，按每只小鼠300 μL估算用量。将所有材料以及流式细胞术等所需的额外离心管一并放入次级容器中，以便转运至动物房。
4. 进入和离开动物实验设施时，须遵循所有必要的准入程序，包括正确穿脱个人防护装备。
   警告： 所有操作均须在生物安全二级实验室（BSL-2）内的经认证的生物安全柜中进行。
5. 根据动物的大小和体重，经腹腔注射200–500 μL麻醉剂。若单独操作，应逐只给予麻醉，以避免在器官采集前动物死亡。
   1. 通过镊子夹捏脚趾以评估足底反射来确认麻醉剂量。若小鼠仍有反应，则不得继续操作。使用图钉将小鼠固定于石蜡板上。此时，用70%乙醇充分浸润小鼠体表，以避免在器官采集过程中毛发污染。
6. 通过心脏穿刺进行终末放血。
   1. 使用剪刀和镊子通过胸腔打开动物体，暴露心脏。通过心脏穿刺采集血液（约800 µL），可用于多种检测，包括临床化学、血液学、流式细胞术检测抗原特异性反应，以及实时定量PCR（qRT-PCR）分析病毒拷贝数。
   2. 用于qRT-PCR病毒RNA分析时，若从全血中提取，应将血液收集至EDTA管中；若从血清中提取，则收集至微量离心管中。（对于血清样本，于室温下以最大转速离心20分钟，然后将血清转移至另一管中。）在血清样本中完成上述步骤后，加入线性聚丙烯酰胺作为载体。RNA随后可用于分析，或于-80 °C保存以备后续处理。
7. 用室温（或37 °C）的PBS填充20 mL注射器，通过将蝴蝶针插入左心室对小鼠进行灌注。穿刺右心房以使血液和PBS流出。缓慢注入PBS，同时观察肝脏颜色变化，以确认动物已完全灌注。肝脏颜色应由深红色变为粉红色三文鱼色。
   1. 若准备将器官用于组织学分析，需保持蝴蝶针原位，随后用20 mL冰冻的4%多聚甲醛灌注。此时，可将注射器连接至一个三通旋塞阀，两个注射器均连接于该阀上，交替使用PBS和PFA时，通过旋转阀门控制通断即可。
8. 将器官收获至已标记并称重的试管中。对于外周器官，按照既定顺序进行采集：肝脏、脾脏、肾脏和肺。
   1. 仅取肝脏的一个叶，具体哪个叶并不重要，但所有实验中应尽量选取相同叶且取相同大小的组织。同样，对于肾脏和肺，也应始终选取相同的肾脏和肺。如果还需进行流式细胞术，可将任一器官切成两半。将用于流式细胞术的一半组织置于室温的罗斯韦尔公园纪念研究所培养基（RPMI）中保存，直至所有组织取材完成。
   2. 收获后立即把每个器官放入标记好的试管中，并置于干冰浴中。病毒滴度在室温下会随时间下降，因此收获器官所需的时间极为重要。必须保证各小鼠之间操作的一致性，因此在确保安全的前提下，下一步的关键是速度。
      注意： 若需收获器官以测定病毒滴度，此时由第二位操作者收获脑组织将非常有助于保持病毒滴度。
9. 移除小鼠体腔中剩余的器官，以暴露脊柱和颅骨。
   1. 将小鼠从固定板上取下，去除毛皮，然后切除四肢。  
      用断头法或手术剪去除小鼠头部，通过枕骨大孔用锯齿状拉格朗日剪刀剪开颅骨以获取脑组织。然后用镊子剥除颅骨，并用刮勺取出脑组织。
   2. 使用锋利的钝头剪刀，剪除脊柱周围肋骨及其他骨骼。随后横切骨盆骨，暴露腰段椎管。此时应可见脊髓末端的小突起。
   3. 使用装有 PBS 的 10 mL 注射器和 18 G 针头，从腰段向颈段脊柱方向冲洗脊髓，将脊髓冲出至培养皿中。
   4. 小心地将针头斜面尖端插入椎间孔内，避免施加过大压力，以防针头穿破椎体。牢固握住针头，向椎体施加压力，同时推动注射器活塞以推出脊髓。立即将脊髓转移至标记好的试管中，并置于干冰浴中。
10. 对所有动物重复该操作，直至完成取材。在每只动物之间，将取材工具置于70%乙醇中。注意操作的一致性与速度。各器官取材之间的时间间隔应保持一致，以避免对病毒滴度结果造成偏差。
11. 实验结束后，在将材料移出动物实验设施之前，需对生物安全柜及所有物品进行消毒。
12. 从冰浴中取出每个试管，称量试管以确定器官重量。计算器官重量时，用含器官试管的重量减去空试管的重量。      
    注意： 此时，器官可于 -80 °C 冻存，以备后续处理；或可立即进行匀浆，再将单份样品分装后冻存。反复冻融会降低病毒滴度。因此，在同一项目的所有实验中，必须采用相同的操作流程。

2. 器官匀浆

1. 为每个待匀浆的器官准备3个已标记的1.5 mL带盖离心管。
2. 如果样品在收获后不立即进行匀浆处理，请将离心管从-80 °C取出。样品无需解冻即可进行匀浆。
3. 将样品置于冰上以保持低温，尽量减少病毒滴度损失。然后向每支含有组织的离心管中加入1 mL含5% FBS的冷DMEM培养基。
4. 根据制造商说明，立即使用珠磨仪对离心管进行震荡破碎。所有组织均需使用钢珠在珠磨匀浆仪中进行匀浆处理。检查以确保每个组织均已完全匀浆。
5. 在已预冷至8 °C的微量离心机中，以12,000 x g 离心5分钟，沉淀组织碎片。然后将离心管放回冰桶中。在生物安全柜内，将样品分装至不同离心管中用于后续必要的检测。分装后再次将离心管放回冰桶中。
6. 对于焦点形成实验，将500 µL样品分装至已标记的离心管中，然后将离心管放置于冰桶中的试管架上。另取50 µL样品分装至另一离心管中，用于荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测病毒基因组拷贝数的RNA提取。
7. 使用商用RNA提取试剂盒从感染动物的组织中提取总RNA。采用针对ZIKV的特异性引物-探针组检测黄病毒属病毒RNA，该引物探针可识别各黄病毒基因组中的特异序列。使用含有通过体外T7聚合酶合成的、定义明确的阳性单链RNA（包含ZIKV靶序列）的拷贝数对照质粒，确定病毒拷贝数。
8. 将剩余样品（约300 µL）分装至第三支离心管中，必要时储存于-80 °C。
   注意： 若样品此前未冷冻，则应于-80 °C冷冻保存；若样品此前已冷冻，则应在停止操作前继续进行焦点形成实验和/或RNA提取 再行终止。

3. 寨卡病毒焦点形成实验

注意： 必须设置无病毒对照和阳性对照。阳性对照为已知浓度的病毒原液的系列稀释样本。所有对照不一定需在同一块培养板上进行，但当检测规模超过5块板时，应增加更多对照，并将其均匀分布在各板之间。操作时需注意避免移液枪头或剧烈洗涤对单层细胞造成划伤。多个器官样本可在同一天或不同天进行滴定检测，但单个器官样本不应跨多天完成检测，因为不同的检测条件可能影响病毒滴度。强烈建议在同一天内完成单个器官样本的全部检测。

1. 在进行检测的前一天，准备好焦点形成检测所需的细胞和试剂。
   1. 准备生长培养基，其中包含500 mL DMEM、5 mL HEPES和25 mL FBS。在检测开始前，将Vero-World Health Organization (WHO)细胞在37 °C、5% CO₂ 条件下于生长培养基中培养。Vero细胞不应使用高代次细胞，且在检测开始前不得生长至超过100%汇合度。
   2. 通过高压灭菌制备500 mL 2%甲基纤维素溶液：将10 g甲基纤维素和一个大搅拌子放入1 L玻璃培养瓶中，另取一个1 L玻璃培养瓶加入500 mL H₂O进行高压灭菌。若灭菌后的水已冷却，可将其放入微波炉重新加热至瓶壁手感温热但未沸腾。
   3. 在生物安全柜中，将温热/热水缓慢倒入装有甲基纤维素的瓶子中。盖上部分瓶盖，在加热板上搅拌直至甲基纤维素完全溶解（1–4小时）。将2%甲基纤维素溶液分装至无菌50 mL锥形管中。2%甲基纤维素溶液可于4 °C保存，待用。
   4. 用PBS配制5%多聚甲醛溶液用于固定培养板，并于4 °C保存至使用。通过向PBS中加入0.05% Triton X-100制备1×焦点形成检测洗涤缓冲液，并于室温保存。通过向PBS中加入1 mg/mL皂苷制备1× FFA染色缓冲液，并于4 °C保存至使用。这些缓冲液可提前1–2周配制。
2. 根据实验需求计算所需平底96孔板的数量，确保每个器官样本以三复孔形式接种。同时预留足够的额外孔用于阳性和阴性对照。
   1. 在生长培养基中培养足够数量的Vero细胞以完成实验设计。用胰酶消化Vero细胞，重悬于生长培养基中，调整细胞密度为1.5 × 10⁵ 个细胞/mL。向96孔平底板中每孔加入200 µL，接种量为每孔3.0 × 10⁴ 个Vero-WHO细胞。
   2. 将培养板置于37°C、5% CO₂ 条件下过夜培养，确保培养板在孵育箱中保持水平，使细胞在孔内均匀分布。
      注意： 各实验室培养Vero细胞的条件略有不同；目标是在寨卡病毒检测当天，每个孔形成90–95%汇合的单层细胞。
3. 在检测当天稀释寨卡病毒样本。若器官样本此前已匀浆，从-80 °C冰箱中取出样本，先使其解冻，再置于冰上待用。
   1. 在冰上操作，向圆底96孔板的B至H行每孔加入180 µL冷生长培养基，A行留空。向圆底板A行各孔加入150 µL匀浆后的器官样本。
   2. 使用多通道移液器对各样本进行连续10倍梯度稀释。在圆底96孔板中，将20 µL样本加入180 µL生长培养基中进行稀释，每次稀释均需更换移液器吸头。
4. 通过移除覆盖Vero细胞的平底96孔板中的培养基来准备焦点形成板。此步骤应在添加病毒样本前立即进行，以防止单层细胞干燥。
   1. 向Vero细胞板的每孔加入100 µL病毒稀释液。使用同一组吸头，从最低浓度向最高浓度依次加样。轻轻左右摇动培养板2–4次，注意避免旋转混匀。
   2. 在37 °C、5% CO₂ 条件下孵育1–2小时。确保培养板在孵育箱中保持水平。孵育期间将2%甲基纤维素溶液升温至室温。
   3. 用生长培养基稀释2%甲基纤维素溶液，稀释比例约为2:1（2%甲基纤维素:生长培养基）。保持其在室温下直至使用。向96孔板每孔加入1–2滴（设定移液器为125 µL）甲基纤维素-生长培养基混合液。
   4. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育32–40小时。由于不同实验室的Vero细胞生长速度存在差异，且细胞汇合度和寨卡病毒毒株等因素可能影响孵育时间，需根据实际情况调整。
5. 使用预先配制的5%多聚甲醛溶液固定Vero细胞。
   1. 在生物安全柜中，向每孔甲基纤维素层上方加入50 µL 5%多聚甲醛溶液，在室温下孵育60分钟。固定过程也可在4 °C过夜进行，但需用封口膜覆盖培养板以减少蒸发。
   2. 在生物安全柜内将覆盖层和培养基倾倒至废液容器中。用PBS轻柔洗涤，每孔150 µL。吸除PBS后，将培养板移出BSL-2实验室。
   3. 重复PBS洗涤2次，每次每孔加入150 µL。随后吸除PBS。每孔加入150 µL 1× FFA洗涤缓冲液，在室温下孵育5–10分钟以通透固定后的细胞。
6. 使用一抗检测感染。将一抗4G2（D1-4G2-4-15）用FFA染色缓冲液稀释至1 μg/mL浓度。根据整个实验所需量配制足够的一抗。
   注意： 避免使用实验室用纸尿布或其他高纤维脱落性吸水材料，因其纤维会干扰焦点成像。
   1. 从培养板中移除FFA洗涤缓冲液。每孔加入50 µL用FFA染色缓冲液稀释的一抗。用封口膜密封培养板，在4 °C摇床上过夜孵育。也可在室温下孵育2小时完成该步骤。
7. 通过添加HRP标记的二抗可视化感染。将二抗（HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体）用FFA染色缓冲液按1:5,000比例稀释。根据整个实验所需量配制足够的二抗。
   1. 用FFA洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次轻轻甩去洗涤液至水槽中。每孔加入50 µL用FFA染色缓冲液稀释的二抗进行染色，在室温下孵育1–2小时。
   2. 用FFA洗涤缓冲液洗涤细胞3次，每次轻轻甩去洗涤液至水槽中。每孔加入50 µL Trueblue底物溶液。
   3. 密切观察培养板，等待2–15分钟，直至斑点清晰且背景最低。斑点显现后，用清水轻柔冲洗，用手遮挡以避免水流冲击单层细胞。用纸巾轻拍干燥（切勿使用纸尿布），并尽快成像。
   4. 斑点可手动计数或使用自动斑点计数器进行计数。若手动计数，可借助解剖显微镜辅助观察。
   5. 对每个样本，选择焦点清晰可辨（例如每孔20–200个）的稀释度，根据双复孔的平均值计算每毫升焦点形成单位（FFU/mL）的滴度：FFU/mL =（每孔平均焦点数）×（稀释倍数）÷（接种体积/mL）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-溴-3-氯丙烷（BCP）	MRC gene	BP151
10 cc 注射器	Thermo Fisher Scientific	BD 309642
18G 针头	Thermo Fisher Scientific	22-557-145
1 cc 结核注射器	Thermo Fisher Scientific	14-823-16H
20 cc 注射器	Thermo Fisher Scientific	05-561-66
24 孔珠磨机	Thermo Fisher Scientific	15 340 163
3.2 mm 不锈钢珠	Thermo Fisher Scientific	NC9084634
37°C 组织培养孵育箱	Nuair	5800
4G2 抗体	in house
96 孔平底板	Midsci	TP92696
96 孔圆底板	Midsci	TP92697
Basix 1.5 ml 离心管	Thermo Fisher Scientific	02-682-002
浓缩杀菌漂白剂	Staples	30966CT
CTL S6 分析仪	CTL	CTL S6 Universal Analyzer
弯头剪刀	Fine Science Tools	14061-11
杜尔贝科改良伊格尔培养基（高糖，含 4500 mg/L 葡萄糖）	MilliporeSigma	D5671
乙醇（分子生物学级）	MilliporeSigma	e7023
胎牛血清	MilliporeSigma	F0926-500ML
镊子	Fine Science Tools	11036-20
冰醋酸	MilliporeSigma	537020
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体	MilliporeSigma	8924
HEPES 1 M	MilliporeSigma	H3537-100ML
异丙醇（分子生物学级）	MilliporeSigma	I9516
氯胺酮/赛拉嗪混合液	Comparative Medicine
L-谷氨酰胺	MilliporeSigma	g7513
Magmax RNA 纯化试剂盒	Thermo Fisher Scientific	AM1830
甲基纤维素	MilliporeSigma	M0512
微量离心机	Ependorf	5424R
MiniCollect 0.5 ml EDTA 管	Bio-one	450480
O 型圈管	Thermo Fisher Scientific	21-403-195
一步法 qRT-PCR 混合液	Thermo Fisher Scientific	4392938
多聚甲醛	Thermo Fisher Scientific	EMS- 15713-S
磷酸盐缓冲液	MilliporeSigma	d8537-500ml
Proline 多通道移液器	Sartorius	72230/72240
Proline 单通道移液器	Sartorius	728230
无 RNA 酶水	Thermo Fisher Scientific	10-977-023
RNAzol BD	MRC gene	RB192
摇床平台	Thermo Fisher Scientific	11-676-333
RPMI 1640	Fisher	MT10040CV
皂苷	MilliporeSigma	s7900
药匙/刮勺	Fine Science Tools	10090-17
直头剪刀	Fine Science Tools	14060-11
吐温 X-100	MilliporeSigma	t8787
True Blue 底物	VWR	95059-168
胰蛋白酶	MilliporeSigma	T3924-100ML