一种用于定量感染小鼠器官中病毒滴度的焦点形成实验

摘要

来源：Brien, J. D. 等，小鼠多种器官中寨卡病毒的分离与定量。J. Vis. Exp. (2019)

视频演示了在多种小鼠器官中定量寨卡病毒的实验方法 通过 空斑形成实验。该过程包括用病毒感染的组织匀浆感染哺乳动物细胞单层，随后使用甲基纤维素以阻止病毒扩散。接着采用免疫染色方法，实现对器官特异性感染能力的精确定量与测定。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 器官分离

注意： 病毒在室温（RT）下不稳定，因此必须合理规划单次采集的动物数量，以保持病毒滴度。

1. 根据所需表型，选择适当的剂量和途径感染小鼠。在本方案中，使用 8–10 周龄的雄性和雌性 I 型干扰素受体缺陷型（Ifnar1−/−）小鼠，通过尾静脉注射途径接种 1 × 10³ PFU 的病毒。^-/-C57BL/6小鼠
   1. 麻醉 Ifnar1^-/- 小鼠以氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物麻醉。通过用力捏压脚趾测试脚掌反射，以确认麻醉效果。给予1 × 10⁵ 皮下注射（SC）50 μL ZIKV 的焦点形成单位（FFU） 通过 足垫
2. 前一天准备好收获所需的全部材料：2 把剪刀、镊子，以及用于工具消毒的 50 mL 锥形瓶中的 20 mL 70% 乙醇（EtOH）。
   1. 准备注射器和针头：用于灌注的20 mL注射器，23 G针头（每笼约1个），以及配有25 G针头的1 mL注射器（每3-5只小鼠1个）。在称量前，....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-溴-3-氯丙烷（BCP）	MRC gene	BP151
10 cc 注射器	Thermo Fisher Scientific	BD 309642
18G 针头	Thermo Fisher Scientific	22-557-145
1 cc 结核注射器	Thermo Fisher Scientific	14-823-16H
20 cc 注射器	Thermo Fisher Scientific	05-561-66
24 孔珠磨机	Thermo Fisher Scientific	15 340 163
3.2 mm 不锈钢珠	Thermo Fisher Scientific	NC9084634
37°C 组织培养孵育箱	Nuair	5800
4G2 抗体	in house
96 孔平底板	Midsci	TP92696
96 孔圆底板	Midsci	TP92697
Basix 1.5 ml 离心管	Thermo Fisher Scientific	02-682-002
浓缩杀菌漂白剂	Staples	30966CT
CTL S6 分析仪	CTL	CTL S6 Universal Analyzer
弯头剪刀	Fine Science Tools	14061-11
杜尔贝科改良伊格尔培养基（高糖，含 4500 mg/L 葡萄糖）	MilliporeSigma	D5671
乙醇（分子生物学级）	MilliporeSigma	e7023
胎牛血清	MilliporeSigma	F0926-500ML
镊子	Fine Science Tools	11036-20
冰醋酸	MilliporeSigma	537020
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体	MilliporeSigma	8924
HEPES 1 M	MilliporeSigma	H3537-100ML
异丙醇（分子生物学级）	MilliporeSigma	I9516
氯胺酮/赛拉嗪混合液	Comparative Medicine
L-谷氨酰胺	MilliporeSigma	g7513
Magmax RNA 纯化试剂盒	Thermo Fisher Scientific	AM1830
甲基纤维素	MilliporeSigma	M0512
微量离心机	Ependorf	5424R
MiniCollect 0.5 ml EDTA 管	Bio-one	450480
O 型圈管	Thermo Fisher Scientific	21-403-195
一步法 qRT-PCR 混合液	Thermo Fisher Scientific	4392938
多聚甲醛	Thermo Fisher Scientific	EMS- 15713-S
磷酸盐缓冲液	MilliporeSigma	d8537-500ml
Proline 多通道移液器	Sartorius	72230/72240
Proline 单通道移液器	Sartorius	728230
无 RNA 酶水	Thermo Fisher Scientific	10-977-023
RNAzol BD	MRC gene	RB192
摇床平台	Thermo Fisher Scientific	11-676-333
RPMI 1640	Fisher	MT10040CV
皂苷	MilliporeSigma	s7900
药匙/刮勺	Fine Science Tools	10090-17
直头剪刀	Fine Science Tools	14060-11
吐温 X-100	MilliporeSigma	t8787
True Blue 底物	VWR	95059-168
胰蛋白酶	MilliporeSigma	T3924-100ML