剪切应力对经机械感应受体抗体处理的血小板的影响

摘要

来源：Quach, M. E. 等，利用圆锥-平板黏度计进行人血小板及细胞表面受体的均匀剪切力检测。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了评估剪切应力对血小板影响的方法。抗体处理可诱导机械感受器复合物的解离和构象改变，从而激活血小板并在其表面表达标志物。这些标志物可通过免疫染色和流式细胞术进行观察。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 血液采集与血小板分离

1. 在实验当天，通过静脉穿刺从知情同意的健康成年献血者体内采集血液，并使用3.8%枸橼酸钠抗凝。对于血小板计数接近250 × 10³/μL的献血者，一支4.5 mL的采血管所采集的血液足以获得可用于20–25个实验条件的富血小板血浆（PRP）。
   注意：避免使用细径针头（小于21 G）采血。
2. 将血液在22 °C下以140 × g离心12分钟（使用长刹车），制备PRP。离心后将出现两层明显分离的液体，下层为红细胞，上层为浅色的富血小板血浆（PRP）。
3. 使用剪成45°斜角的移液器吸头小心吸取上层浑浊的黄色PRP层，并通过全血细胞计数（CBC）测定血小板数量。
4. 如有必要，在含有前列腺素E1（PGE1）的哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)钠盐（PIPES）缓冲盐水（150 mM氯化钠，NaCl；20 mM PIPES）中洗涤血小板，然后将血小板重悬于含5 mM葡萄糖的Tyrode缓冲液（134 mM NaCl，0.34 mM磷酸氢二钠，Na₂HPO₄，2.9 mM氯化钾，KCl，1 mM氯化镁，MgCl₂，5 mM葡萄糖，12 mM碳酸氢钠，NaHCO₃，20 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸，HEPES，pH 7.35）中；否则直接进入步骤1.5。以下步骤简要描述洗涤过程：
   1. 用PIPES缓冲盐水将PRP体积调至10 mL，并加入0.6 μM PGE1。
   2. 在1,900 × g下离心8分钟，弃去上清液，将血小板沉淀物在400 μL Tyrode缓冲液与葡萄糖溶液中静置5分钟。
   3. 轻柔重悬血小板沉淀物，并静置30分钟，避免扰动。
5. 使用混合人源血小板贫乏血浆（PPP）将血小板浓度调整至约250 × 10³ 个/μL，并将悬液在22 °C下静置或缓慢旋转保存，避免扰动。

2. 抗体与均匀剪切力处理

注意：第2节中所有需要移液的步骤均应缓慢操作，以避免引入任何剪切力。

1. 将所需抗体加入PRP或洗涤血小板中，通过轻轻吹打或用移液枪头搅拌混匀。室温静置5-10分钟。向阴性对照中加入等体积的PPP或Tyrode's缓冲液。
2. 开启锥板黏度计，将板温设置为22 °C，并留出足够时间使板达到该温度。
3. 将处理后的PRP或洗涤血小板直接加至温控锥板黏度计的板中心位置。确保所有样品均沉积在锥与板接触点之间，而非锥边缘外侧。
4. 以适当的速率和持续时间施加剪切力。
   1. 根据黏度计说明书或先前所述方法计算剪切力。
   2. 通过牛顿黏性定律从黏度和所需剪切应力确定剪切速率；；血浆黏度为1.5-1.6厘泊（cP）。例如，人体循环中的正常剪切应力范围为5-30 dyn/cm²，剪切作用时间应在个位数分钟量级。
5. 将锥略微抬起离开板面约2 mm，使样品仍与锥和板保持接触，使用加样枪头或其他长型移液枪头从样品中心吸取5-10 μL。
6. 将经剪切处理的样品与所需标记物在室温下孵育20分钟。针对磷脂酰丝氨酸、β-半乳糖和P-选择素暴露的标记物，分别使用0.08 μM的乳酸脱氢酶C2结构域（LactC2）、6.25 μg/mL的刺槐凝集素（ECL）和20 µg/mL的抗P-选择素抗体。
7. 在稀释或低温保存前，将样品于室温下用2%多聚甲醛固定20分钟，随后进行步骤3.1，或在4 °C保存不超过12小时。

3. 表面标志物的检测与交联 通过 流式细胞术

1. 通过流式细胞术分析样品，每种条件下至少收集 20,000 个事件。
2. 使用每种荧光染料的强度高度值或几何平均荧光强度（MFI）来定量荧光标记信号强度。
3. 若旨在检测剪切处理后血小板的交联情况，则在具备成像功能的流式细胞仪上分析样品，并通过面积和长宽比参数定量交联程度。
   1. 绘制面积和/或长宽比的直方图。
   2. 使用牛血清白蛋白（BSA）或溶剂作为阴性对照，设定门控以排除大多数完全圆形的事件（该门控通常设置在长宽比约 0.8 处），并定量门控内事件所占百分比。长宽比较低的事件更可能为交联状态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APC 抗人 CD62P（P-选择素）	BioLegend	304910
Brookfield Cap 2000+ 黏度计	Brookfield	-
FITC 标记的刺槐凝集素（ECL）	Vector Labs	FL-1141
混合正常人血浆	Precision Biologic	CCN-10
Vacutainer 浅蓝色采血管（柠檬酸钠）	BD	369714
Vacutainer 采血套装，21G × ¾" 针头	BD	367287