一种体外定量检测寄生虫在巨噬细胞内生长的实验方法

摘要

来源：Sarkar, A., 等 巨噬细胞内生长的定量分析是一种快速可靠的毒力评估方法 利什曼原虫 寄生虫。 视频实验杂志 (2018).

本视频展示了一种用于定量检测寄生虫在骨髓来源巨噬细胞（BMMs）内生长的实验方法。巨噬细胞被运动型和非运动型侵袭期寄生虫感染， 利什曼原虫分别为后循环前鞭毛体和无鞭毛体。这些寄生虫侵入巨噬细胞，被内化至寄生泡内并在其中增殖。通过荧光染色巨噬细胞和寄生虫的细胞核后，可在显微镜下定量测定胞内寄生虫的生长情况。

方案

1. 感染用BMMs细胞的盖玻片接种

1. 在每个空的6孔细胞培养板孔底部放置四片（4）无菌的12 mm玻璃盖玻片（经高压灭菌并储存于密闭玻璃容器中）。
   注意：使用连接真空泵的吸头吸取每片无菌12 mm盖玻片。将盖玻片放入孔中时避免重叠，并通过捏紧管子中断真空，使盖玻片在目标位置释放。
2. 吸除已接种附着性骨髓来源巨噬细胞（BMM）的培养皿中的培养基（及任何非贴壁细胞），并用预热至37 °C的无钙镁氯化物的无菌Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS -/-）轻轻冲洗贴壁细胞两次。
3. 向每个培养皿中逐滴加入5 mL含1 mM EDTA的无菌1×PBS -/-，于37 °C孵育5分钟以解离贴壁的BMM。使用显微镜确认细胞是否已解离。
4. 将所有悬浮于含1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的1×PBS -/-中的解离细胞收集至50 mL锥形管中。用5 mL PBS -/-冲洗每个培养皿两次，并将冲洗液加入细胞悬液中。
   注意：在收集过程中，可用额外的PBS -/-稀释细胞悬液，以保护巨噬细胞免受EDTA毒性影响。
5. 在4 °C下以300 × g离心10分钟。弃去上清液，用移液器将巨噬细胞重悬于5–10 mL BMM培养基中。将重悬的细胞置于冰上，以防止其附着于管壁或发生聚集。
6. 使用台盼蓝染色排除法在血细胞计数板中计数活细胞。
   注意：对于重悬于5 mL培养基中的BMM细胞，通常采用25 µL细胞悬液、445 µL PBS -/-和30 µL 0.4%台盼蓝溶液的稀释混合液，可在血细胞计数板中实现易于定量的计数（最终计算时需考虑20倍的稀释因子）。仅计数未被台盼蓝染色的细胞（活细胞）。若该混合液浓度过高或过低，可适当调整细胞悬液体积。通常，每只小鼠单次制备的BMM产量在2 × 10⁷ 至 5 × 10⁷ 个细胞之间。
7. 将细胞悬液用BMM培养基调整至所需接种浓度（5 × 10⁵/mL），并将2 mL细胞悬液分配至6孔板的每个孔中，使每孔含有1 × 10⁶个巨噬细胞。
   注意：此为关键步骤，确保每孔获得足够数量的巨噬细胞，以均匀覆盖盖玻片。检查孔内盖玻片是否重叠或漂浮于培养基中，如有，可用无菌移液器吸头轻轻调整。
8. 于37 °C、5% CO₂条件下孵育过夜。

2. 感染性形式的L. amazonensis的纯化

注意：准备用于感染的Leishmania——从静止期前鞭毛体培养物中纯化出感染性前鞭毛体，或使用标准的L. amazonensis无细胞分化方案将前鞭毛体在培养中分化为无鞭毛体形式。

1. 使用密度梯度介质纯化Leishmania前鞭毛体（材料）
   1. 在无菌、无内毒素的水中配制40%密度梯度介质储备液。
   2. 用10倍浓缩的M199培养基（不含血清）稀释密度梯度溶液，制备含10%浓度密度梯度介质的M199培养基。
   3. 所有溶液均通过0.22 µm滤膜过滤。
      注意：储备液可在避光条件下于4 °C保存，但不得超过1个月。
   4. 在15 mL锥形离心管底部加入2 mL 40%密度梯度介质溶液。
   5. 使用巴斯德移液管，小心地将2 mL M199培养基中的10%密度梯度介质溶液叠加至40%密度梯度层上方，避免两层之间发生混合。
   6. 通过离心（1,900 × g，10分钟）从静止期培养物中收集1 × 10⁹个寄生虫。
   7. 将细胞重悬于6 mL杜尔贝科改良必需培养基（DMEM）中。
   8. 使用巴斯德移液管，轻轻将2 mL细胞悬液直接叠加至10%密度梯度介质层上方，避免各层之间混合。
   9. 在室温下以1,300 × g离心10分钟。
      注意：由于不同Leishmania物种的物理特性存在差异，可能需要略微调整每种物种的离心条件，以确保获得最大产量。
   10. 从上层10%密度梯度介质边界处形成的条带（0%与10%密度梯度介质层之间的界面）收集寄生虫（富含前鞭毛体形式的代谢型前鞭毛体）。
   11. 用等体积的DMEM稀释寄生虫，并通过离心（1,900 × g，室温10分钟）收集。
   12. 重悬于500 µL DMEM培养基中，使用血细胞计数板计数以确定产量。
2. 在无菌培养条件下（低pH/高温）生成L. amazonensis无鞭毛体。
   1. 取5 mL对数生长期的前鞭毛体培养物（pH 7.4，26 ^oC），与等体积的无鞭毛体培养基（pH 4.5）混合，使用25 cm²培养瓶（总体积10 mL培养基），于26 °C过夜培养。
   2. 将培养瓶从26 °C转移至32 °C。
   3. 3或4天后，将培养物以1:5比例在32 °C的无鞭毛体培养基中传代。
   4. 在接下来的3至4天内（最长7天）检查寄生虫，判断其是否可用于感染实验。
      注意：健康的无菌培养无鞭毛体应呈椭圆形，无可见鞭毛。部分分化的无鞭毛体呈较大椭圆形并带有短鞭毛。培养物中不应出现大量聚集体——大量聚集体表明寄生虫未生长或正在死亡。无鞭毛体培养物可按1:5比例传代，最多维持3周。

3. 利什曼原虫亚马逊株（L. amazonensis）感染

1. 根据所需的感染复数（MOI）稀释寄生虫悬液（通常每巨噬细胞3-5个前鞭毛体无鞭毛体，即MOI为1:3或1:5；每巨噬细胞1个无鞭毛体，即MOI为1:1）。将Leishmania用不含钙镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS -/-）稀释至50–100 µL，加入已含有2 mL培养基的各孔中。
2. 将骨髓来源巨噬细胞（BMMs）与无鞭毛体共孵育1小时，或与前鞭毛体共孵育3小时，于34 ^oC条件下进行感染。
   注意：最佳感染温度可能因物种而异。
3. 孵育结束后，用预热至37 °C的2 mL不含钙镁离子的PBS（PBS -/-）彻底清洗各孔3次，以去除未结合的寄生虫。
   注意：轻柔分散PBS，确保盖玻片不会相互漂浮重叠。轻轻摇晃培养板后吸出液体。若使用多种寄生虫株，应使用不同的吸头以避免交叉污染。
4. 对1小时或3小时时间点的样本进行固定：每孔加入1.5–2 mL含2%多聚甲醛（PFA）的PBS -/-溶液，孵育10分钟。随后用PBS -/-洗涤3次。最后一次洗涤后保留PBS，将含盖玻片的培养板置于冰箱中保存于PBS中，直至染色。
5. 对于需要继续培养的后续时间点，每孔加入2 mL新鲜BMM培养基，并于34 °C继续孵育。
6. 根据实验设计，参照步骤4.3所述方法对剩余时间点的样本进行固定，并将培养板冷藏保存至染色前。

4. DAPI 染色与盖玻片封片

1. 吸去含有盖玻片的孔中 PBS，加入 1.5 mL 含 0.1% 非离子型去垢剂的 PBS -/-。室温孵育 10 分钟，随后用 2 mL PBS -/- 洗涤 3 次。
2. 向含有盖玻片的孔中加入 1 mL 含 2 µg/mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（用水将 5 mg/mL 储存液稀释而成）的 PBS -/-，室温再孵育 1 小时。
   注意：DAPI 孵育时间对于正确观察细胞内 Leishmania 寄生虫至关重要。由于巨噬细胞核体积较大且 DNA 含量高，染色较快；而细胞内寄生虫的细胞核染色较慢。因此，必须延长孵育时间，超过仅可视化 BMM 细胞核所需的时间，以使 DAPI 能够穿透寄生虫的质膜和核膜。适当染色后，除核 DNA 外，还可观察到位于寄生虫鞭毛窝附近的线粒体动基体 DNA。
3. 用 2 mL PBS -/- 对每孔含盖玻片的样品洗涤 3 次，然后用镊子小心提起并翻转盖玻片，使细胞面朝下，用市售的抗荧光淬灭封片试剂将其封固在玻璃显微镜载玻片上。
   注意：盖玻片极为脆弱，需谨慎操作。在提起过程中避免对其施加压力，尤其不要触碰孔壁。加入数滴 PBS -/- 可降低盖玻片与孔板之间的表面张力，有助于顺利提起。可使用细针辅助将盖玻片从孔底撬起。将盖玻片放置于载玻片上后，用镊子轻轻按压，以排出封片介质中的气泡。若盖玻片破裂或在提起过程中可能已翻转，请勿重新封片；直接使用备用的第四张盖玻片即可。
4. 将载玻片冷藏保存，直至进行定量分析。

5. 感染定量

1. 使用100倍油镜（浸油）在荧光显微镜下观察DAPI染色的载玻片，聚焦于巨噬细胞（激发波长358 nm，最佳发射波长461 nm）。
   确保聚焦于玻璃载片与盖玻片之间的巨噬细胞层。
2. 定量分析巨噬细胞数量（经DAPI染色的大型细胞核）以及围绕每个巨噬细胞核聚集的较小无鞭毛体细胞核数量（参见 图1A，DAPI）进行计数。
   注意： 由于无鞭毛体的细胞核体积较小，可能无法在同一焦平面上全部观察到。先在巨噬细胞细胞核的焦平面计数可见的细胞核，然后使用微调焦旋钮检查巨噬细胞细胞核上下焦平面是否存在其他寄生虫细胞核。
3. 移动到另一个视野以重复定量。使用独立的计数键记录已计数的视野数量。在每个盖玻片上以平行排的方式移动视野，避免重复计数。
4. 每盖玻片至少定量200个巨噬细胞。每个感染时间点需设置三份重复（3个盖玻片）。若先前的盖玻片因重叠、封片质量差或玻片破裂等原因不适合计数时，需计数第四个盖玻片。 等等。
   注意： 如果在任意一个盖玻片上无法计数到200个巨噬细胞，则计数备用的第四个盖玻片。
5. 根据原始定量数据，计算感染率，以每巨噬细胞无鞭毛体数或每100个巨噬细胞中的无鞭毛体数表示，并确定被感染巨噬细胞的百分比。

结果

图1：骨髓来源巨噬细胞（BMM）感染毒力型无菌培养的无鞭毛体（A）与非毒力型对数生长期前鞭毛体（B）的代表性示意图 L. amazonensis. 从巨噬细胞中分离的免疫荧光图像 BALB/c 小鼠在感染后1小时和48小时处死。按照本方案所述方法对感染的巨噬细胞进行免疫荧光处理。PV膜使用大鼠抗小鼠Lamp1单克隆抗体（1:1,000稀释）孵育1小时，随后用抗兔荧光标记IgG（1:500稀释）孵育1小时。通过将盖玻片与针对无细胞培养的弓形虫制备的小鼠多克隆抗体孵育，实现对寄生虫的染色...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔细胞培养板	Cellstar	657160
腺嘌呤	Acros Organics	AC147440250
气溶胶屏障移液器吸头（100–1000 μL）	Fisherbrand	02-707-404
气溶胶屏障移液器吸头（20–200 μL）	Fisherbrand	02-707-430
气溶胶屏障移液器吸头（2–20 μL）	Fisherbrand	02-707-432
Bard-Parker 肋纹碳钢手术刀片 #10	Aspen Surgical	371110
BD 鲁尔锁式尖端 10 mL 注射器	Becton Dickinson (BD)	309604
BD Precisionglide 针头，25G	Becton Dickinson (BD)	305124
细胞培养皿 35 mm × 10 mm	Cellstar	627 160
细胞培养瓶	Cellstar	660175
盖玻片：直径 12 mm 圆形	Fisherbrand	12-545-80
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）	Invitrogen	D1306
D-生物素	J.T. Baker	C272-00
EDTA	Sigma Aldrich	EDS
200 证明乙醇	Pharmco-AAPER	111000200
Falcon 100 mm × 15 mm 未进行组织培养处理的聚苯乙烯培养皿	Corning	351029
胎牛血清	Seradigm	1500-500
Ficoll400	Sigma Aldrich	F8016
荧光显微镜	Nikon	E200
山羊抗小鼠 IgG Texas red	Invitrogen	T-862
山羊抗兔 IgG AlexaFluor488	Invitrogen	A-11034
血红素	Tokyo Chemical Industry Co. LTD	H0008
HEPES（1 M）	Gibco	15630-080
Isoton II 稀释液	Beckman Coulter	8546719
L-谷氨酰胺	Gemini	400-106
Medium 199（10 倍浓缩）	Gibco	11825-015
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	11360-070
多聚甲醛	Alfa Aesar	43368
青霉素/链霉素	Gemini	400-109
磷酸盐缓冲液（不含钙镁）	ThermoFisher	14200166
聚丙烯圆锥形离心管 15 mL	Cellstar	188 271
聚丙烯圆锥形离心管 50 mL	Cellstar	227 261
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36930
大鼠抗小鼠 Lamp-1 抗体	发育研究杂交瘤库	1D4B
重组人 M-CSF	PeproTech	300-25
Reichert Bright-Line 血细胞计数板	Hausser Scientific	1492
RPMI 1640 培养基（1 倍浓度）	Gibco	11875-093
表面活性剂 Triton X-100	Millipore Sigma	TX1568-1
台盼蓝	Sigma Aldrich	T8154
精细剪刀，4 1/2"	VWR	82027-582
解剖镊，细尖头	VWR	82027-386
显微镜载玻片	VWR	16004-368
Z1 库尔特颗粒计数器，双阈值	Beckman Coulter	6605699