一种用于定量抗菌蛋白酶活性的染料释放检测法

摘要

来源：Farris, M. H. 等，蛋白类抗菌物质的定性与定量检测及表征方法，J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了用于定量抗菌蛋白酶活性的染料释放测定法。抗菌蛋白会降解细菌带有染料标记的细胞壁，释放出染料分子，使溶液变为蓝色。溶液的吸光度与抗菌蛋白的酶活性呈正相关。

方案

1. 细菌的制备

注意：在微载玻片扩散实验和染料释放实验中，均使用全细胞细菌底物和纯化的肽聚糖作为酶反应底物。这些底物在进行酶反应前需要预先制备。以下方案描述了其制备方法。

1. 全细菌细胞底物
   1. 通过将2 ml过夜培养的 Bacillus subtilis 168（美国模式培养物集存库；ATCC 23857）接种至500 ml营养肉汤中，制备细菌细胞底物。在30 °C条件下振荡培养（125 rpm），直至菌液进入对数生长期，即细菌数量快速倍增的生长阶段。对于 Salmonella enterica subsp. enterica （ATCC 10708）的培养，使用营养肉汤作为生长培养基，在37 °C条件下振荡培养（125 rpm）。
   2. 在3 atm压力下，于121 °C高压灭菌10分钟，使各培养物热灭活。
   3. 在5,000 x g条件下离心20分钟，收集热灭活的细菌底物。用I型水洗涤沉淀物三次，并用少量水重悬。本研究中，将底物悬浮于1,200 µl水中。
   4. 将300 µl细菌细胞底物分装至1.5 ml微量离心管中，于20 °C保存。

2. 底物标记——Remazol Brilliant Blue R 染料标记

注意：在染料释放实验中，底物共价连接至丽丝胺亮蓝R染料。以下方案描述了染色酶底物的制备过程。

1. 通过将 1 g 氢氧化钠（NaOH）溶解于 99 ml Ⅰ型水中，配制 250 mM 氢氧化钠（NaOH）溶液，用于后续配制 200 mM 丽丝胺亮蓝 R 染料（RBB）溶液。
2. 将 1.25 g RBB 溶解于 98.75 ml ± 1 ml 新鲜配制的 250 mM NaOH 溶液中，配制 200 mM RBB 溶液。
3. 将热灭活的细菌细胞以 0.5 g 湿重/30 ml 的浓度重新悬浮于 RBB 溶液中；对于纯化的肽聚糖，则以 0.3 g 湿重/30 ml 的浓度将肽聚糖重新悬浮于 RBB 溶液中。
4. 将反应混合物置于锥形瓶中，在 37 °C 下于旋转平台上温和振荡孵育 6 小时。
5. 将反应混合物转移至 4 °C 培养箱中，继续在温和振荡条件下孵育 12 小时。
6. 孵育结束后，于 3,000 x g 离心 30 分钟，收集染色底物，并倾去上清染料溶液。
7. 通过反复用水（约 3–5 次）洗涤染色标记的细胞或肽聚糖，并每次洗涤后离心，以去除非共价结合的可溶性染料。每次加水后需充分重悬沉淀。
   注意：当离心后的水洗液中不再可见游离的可溶性染料时，应对底物再进行一次额外洗涤。请注意，底物仍呈蓝色，而最后一次洗涤的上清液应为无色透明。
8. 将染色后的底物以少量水悬浮，于 -20 °C 保存，以备后续使用。

3. 定量染料释放实验

注意： 在染料释放实验中，酶促反应中RBB标记底物的水解会将染色产物释放到反应上清液中。通过比色法测定释放染料的量，可反映样品中特定酶的酶活性水平。该定量方法可用于比较不同酶在不同底物上的活性，并允许改变影响酶促反应的环境条件（例如，温度、盐度和pH）。以下方案描述了用于定量检测蛋白质抗菌剂酶活性的染料释放实验的准备与操作步骤。

1. 染料释放实验的准备工作
   1. 将冷冻的染色底物恢复至室温，并用测定缓冲液（磷酸盐缓冲液，PBS）洗涤两次，该缓冲液根据所用酶的经验确定。
   2. 通过将200 µl反应体积乘以拟进行的染料释放实验数量，计算所需底物悬浮液的体积。
   3. 将染色底物加入步骤4.1.2中确定体积的测定缓冲液中，配制底物悬浮液，使用分光光度计在595 nm处测定其光密度（OD），直至达到2.0。为避免超出分光光度计的功能范围，可将浓缩液按1:1稀释后测得OD₅₉₅ 为1.0。使用测定缓冲液作为空白对照。
      注意：可根据高效酶的活性水平，将反应中底物的浊度调高至超过2.0。
   4. 将待测的蛋白质类抗菌物质用测定缓冲液悬浮，预估浓度为1 mg/ml。
   5. 按照BCA蛋白定量试剂盒（Bicinchoninic acid Protein Assay Kit）的制造商说明书，使用微孔板法测定待测蛋白样品的实际浓度，并用测定缓冲液将储备悬浮液的浓度调整至1 mg/ml。
2. 利用染料释放实验确定蛋白质类抗菌物质的最佳孵育条件
   1. 将储备的蛋白质类抗菌物质悬浮液稀释至100 ng/µl。此浓度可使加入反应体系的每10 µl体积中含有1 µg的蛋白质，达到最终反应质量。
   2. 确定拟评估的溶菌蛋白的温度范围。本实验中测试的温度范围包括5 °C、15 °C、25 °C、35 °C、45 °C、55 °C和65 °C。
   3. 在0.5 ml微量离心管中进行反应实验。针对每个温度条件，向200 µl已配制的底物悬浮液中加入10 µl储备蛋白溶液。
   4. 在热循环仪中孵育8小时，每小时轻轻翻转混匀一次。
   5. 孵育结束后，加入25 µl乙醇终止反应。
   6. 以3,000 x g离心2分钟，去除未消化的不溶性底物，并小心转移每种反应混合物的150 µl上清液至96孔平底微孔板中，注意避免扰动未消化底物形成的沉淀。
   7. 通过测定酶解后从底物中解离出的可溶性RBB染料的量，评估该蛋白质类抗菌物质对特定底物的酶活性。为量化酶活性，使用微孔板分光光度计在595 nm处测定上清液的吸光度。可溶性染料从标记底物释放进入上清液所导致的吸光度升高，是酶活性的定量指标。
      注意：吸光度的变化以活性单位（AU）表示，其中1 AU对应染料释放反应上清液在595 nm处光密度增加0.01。空白对照反应包含所有反应组分但不含酶，用于扣除因孵育过程本身导致RBB标记底物释放的染料。最佳酶反应温度对应最高的活性单位值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
48孔平底微孔板，带低蒸发盖	Becton Dickinson	3078
96孔平底微孔板（Costar 3595）	Corning, Inc.	3595
琼脂糖	Fisher Scientific	BP162-100
Bacillus subtilis 168	American Type Culture Collection	23857
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad
McFarland比浊标准液（2.0）	Fisher Scientific	R20412
营养肉汤	Fisher Scientific	S25959B
磷酸盐缓冲液（1×）	Teknova	P0200
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒	Life Technologies	23227
Synergy HT 微孔板分光光度计	BioTek Instruments, Inc.
雷马素亮蓝R染料（RBB）	Sigma-Aldrich	R8001
氢氧化钠（NaOH）	Fisher Scientific	S318-500
UltraPure 去离子水	Invitrogen	10977-015
溶液
营养肉汤培养基
4 g 营养肉汤
500 ml I型水
250 mM 氢氧化钠（NaOH）溶液
1 g NaOH
99 ml I型水
200 mM 雷马素亮蓝R染料（RBB）
1.25 g RBB
98.75 ml 250 mM NaOH 溶液