一种用于评估细菌菌株氧化应激反应的斑点平板实验方法

摘要

来源：Ketelboeter, L. M. 等，抑制细菌脓黑色素生成及其对氧化应激敏感性增加的检测方法。视觉化实验杂志 (2015)

本视频展示了一种用于评估细菌菌株氧化应激反应的斑点平板实验方法。某些菌株能够产生一种抗氧化色素——吡咯黑素。相反，经测试试剂处理后导致吡咯黑素生成减少的菌株，对氧化应激的敏感性增加，与能够产生吡咯黑素的菌株相比，其细胞活力下降。

方案

1. 培养基、抗生素和2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰]-1,3-环己二酮（NTBC）的配制

1. 制备LB（Luria-Bertani）液体培养基（1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，0.25% 氯化钠，NaCl 溶于 H₂O），分装至适当体积。经高压灭菌后，室温保存。
2. 在250 ml 三角瓶中制备100 ml LB 琼脂培养基（1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，0.25% NaCl，1.5% 琼脂溶于 H₂O）。高压灭菌后，室温保存。倾注平板前需确保琼脂完全融化。
   注意： 每个含100 ml LB 琼脂的三角瓶可制备4个平板。可根据实验所需平板数量调整LB琼脂的制备量。
3. 制备磷酸盐缓冲液（PBS）（137 mM NaCl，2.7 mM 氯化钾，KCl，10 mM 磷酸氢二钠，Na₂HPO₄，2 mM 磷酸二氢钾，KH₂PO₄）。通过高压灭菌或过滤灭菌，室温保存。
4. 制备庆大霉素、卡那霉素和妥布霉素的抗生素储备液。
   1. 为 Pseudomonas aeruginosa 菌株配制适当浓度的抗生素储备液，包括100 mg/ml 庆大霉素、30 mg/ml 卡那霉素和10 mg/ml 妥布霉素。将抗生素溶于水中，经0.2 µm 滤膜过滤灭菌，4 °C 保存。根据所研究的细菌种类调整抗生素种类及其浓度。

2. 氧化应激反应的点板检测法

1. 接种待测菌株的过夜培养物。向16 × 150 mm试管（每株一管）中各加入2 ml LB液体培养基，并分别接种各菌株的单个分离菌落。在空气培养箱中，于37 °C、振荡条件下使用组织培养旋转仪振荡培养过夜。
2. 测量OD₆₀₀ 过夜培养物的处理。在测定OD前洗涤培养物₆₀₀ 读数以消除培养基中残留的脓黑色素。
3. 将1 ml培养物在微型离心机中以16,000 × g离心2 min。用微量移液器弃去上清液及任何未紧密沉淀的细胞，将紧实的细胞沉淀重悬于1 ml LB培养基中。
4. 第二天，制备含有 H 的 LB 琼脂平板₂O₂ 作为氧化应激诱导剂。一系列 H₂O₂ 从 0 到 1 mM 的浓度是一个良好的起点。
   1. 融化LB琼脂瓶中的琼脂。在室温下将培养基冷却至约50 °C。
   2. 加入 H₂O₂ 直接加入至冷却的培养基中，达到所需浓度，轻轻摇动锥形瓶以混匀。参见 表1 H的浓度₂O₂ 浓缩 H 的体积₂O₂ 添加。这些数值基于 100 ml 的 LB 琼脂。
   3. 加入 H 后立即倒平板₂O₂ 并灼烧表面以去除气泡。每100 ml LB琼脂可制备4块平板。用H标记平板₂O₂ 浓度
   4. 将平板置于运行中的生物安全柜内，敞开放置30分钟，以去除平板表面多余水分。      
      注意： 同一天制备的培养皿需在当天使用，否则可能导致数据不一致。
      注意： 氧化应激因子（如百草枯）可替代H₂O₂ 在此检测中，其他氧化应激剂的使用浓度可能与H所用浓度不同₂O₂.
5. 洗涤并测定OD值₆₀₀ 过夜培养物的
6. 标准化OD₆₀₀ 将所有过夜培养物的数值归一化至被测菌株组中的最低值。 P. aeruginosa 通常具有 OD₆₀₀ 在LB培养基中过夜培养后，OD值约为2.5。
   1. 确定将培养物稀释至最低OD所需的培养液体积₆₀₀ 在总体积为1 ml的条件下。例如，如果一种培养物的OD₆₀₀ 3 和最低的 OD₆₀₀ 对于该组菌株，其数值为2.5，进行如下计算：(2.5)(1 ml) = (3)(x)。解得 x = 0.833 ml。将0.833 ml的培养物加入微量离心管中。
   2. 计算所需LB + DMSO的体积，使培养物体积达到1 ml。以步骤4.4.1中的示例为例，加入培养物中的LB + DMSO体积为0.167 ml（总体积1 ml – 0.833 ml培养物）。根据所有菌株稀释所需的总体积，配制用于这些稀释的LB + DMSO储备液。
   3. 将培养物与LB + DMSO通过涡旋振荡混合。
7. 为保持培养物中DMSO浓度恒定，用PBS + DMSO对归一化的过夜培养物进行10倍系列稀释。
   1. 配制 PBS + DMSO 储存液。针对一个菌株的一组稀释液，将 300 µM 体积的 DMSO 与 PBS 混合，使总体积为 720 µl。根据所测试菌株的数量，按比例增减该储存液的配制量。
   2. 为10个微量离心管贴标签^-1 通过 10^-7 系列稀释。向相应试管中加入90 µl PBS + DMSO。对于在LB + DMSO中培养的菌株，使用PBS + DMSO。
   3. 加入10 µl培养物至相应的10^-1 稀释管。涡旋混匀，取10 µl的10^-1 稀释至10^-2 稀释管。重复操作直至完成所有稀释步骤。每次稀释之间更换移液器吸头。
8. 点样 5 µl 的 10^-3 通过10^-7 LB + H 稀释液₂O₂ 每种菌株设置两个重复平板。若从最稀释到最不稀释（10⁻⁶）的顺序进行点样，可使用同一个移液枪头。^-7 到 10^-3不要在液体干燥前倾斜或翻转平板。
9. 将培养板孵育 24–48 小时 37 °C（空气培养箱）培养，具体条件取决于菌株。
   注意： P. aeruginosa PAO1 在 LB 培养基上培养 24 小时后将形成大小适中的菌落 孵育。将菌株孵育至其菌落大小与PAO1大致相同。
10. 使用位于透射光源上方的CCD相机拍摄平板照片。可选地，调整照片对比度并裁剪至相同尺寸。计数每个点中的菌落数量，以确定对氧化应激敏感性的变化。

表1：氧化应激斑点平板实验中需添加至LB琼脂的H₂O₂ 浓度。 本表格列出了不同H₂O₂ 浓度及其对应在100 ml LB琼脂中需加入的浓H₂O₂ 储存液体积。

H2O2 的终浓度（mM）	需加入的 9.79 M H2O2 （30% wt）体积（µl）
0	0
0.2	2.04
0.4	4.09
0.6	6.13
0.8	8.17
1	10.21

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮 (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	又称尼替西农。可溶于DMSO。
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt.% 水溶液。已稳定化。