评估测试化合物在肉汤中抗分枝杆菌的效果

摘要

来源：Zheng, X., 等 靶向细胞内目标抑制剂的药效与细胞毒性筛选系统 结核分枝杆菌. 视频实验杂志 (2017)

本视频展示了一种在液体培养基中进行的实验方法，用于测定杀菌性抗生素对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的效力。将细菌培养物与不同浓度的杀菌性抗生素共同孵育，通过刃天青（resazurin）还原实验检测活菌的存在，从而评估其杀菌效果。

方案

1. 细菌菌株与培养基

1. 将25 g牛血清白蛋白、10.0 g葡萄糖和4.05 g氯化钠溶于460 mL去离子水中，配制白蛋白-葡萄糖-盐储备液（ADS）。对ADS溶液进行过滤除菌，并于4 °C保存。
2. 将4.7 g 7H9粉末和2 mL甘油加入900 mL纯化水中，配制7H9液体培养基。在121 °C下高压灭菌10分钟，随后冷却至室温。向900 mL 7H9液体培养基中加入100 mL ADS溶液和0.5 mL Tween80，制得7H9ADST培养基，并于4 °C保存。
3. 称取50 mg硫酸卡那霉素，溶于1 mL去离子水中，终浓度为50 mg/mL。过滤除菌后于-20 °C保存。每1 L 7H9ADST培养基中加入0.5 mL卡那霉素储备液。
   注意：该培养基应新鲜配制，请根据培养规模相应调整各组分体积。
4. 在添加卡那霉素的7H9ADST培养基中静置培养M. tuberculosis。每日振荡混匀培养物，并在OD₆₀₀达到1.0之前进行稀释，以避免菌体聚集。
   注意：本方法开发过程中所使用的M. tuberculosis菌株为携带pJAK2.A质粒的H37Rv。pJAK2.A是一种基于pMV361载体的整合型质粒，可在hsp60启动子驱动下高水平表达萤火虫荧光素酶基因，并可通过卡那霉素进行筛选。

2. 使用刃天青检测法进行液体培养物中的活性分析

1. 将结核分枝杆菌（M. tuberculosis）在7H9ADST培养基中培养至对数中期（~0.5 - 0.8 OD600）。用7H9ADST培养基将菌液稀释至OD₆₀₀为0.01。将待测化合物用7H9ADST培养基稀释至测试浓度的2倍，然后向每孔中加入100 µL稀释后的化合物溶液。
2. 向每孔中加入100 µL稀释后的细菌悬液。将培养板置于37 °C、湿度充足的培养箱中孵育5天。将10 mg刃天青（resazurin）溶于100 mL去离子水中，并通过滤膜除菌。
3. 每孔加入30 µL刃天青溶液，48小时后观察颜色变化；细菌生长表现为颜色由蓝色变为粉红色。
   注意：也可通过检测激发波长530 - 560 nm、发射波长590 nm处的荧光强度，或检测570 nm和600 nm处的吸光度进行定量分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
牛血清白蛋白，pH7	Affymetrix	10857
葡萄糖	Fisher Scientific	BP350
氯化钠	Fisher Scientific	BP358
硫酸卡那霉素	Fisher Scientific	BP906
刃天青	Alfa Aesar	B21187
甘油	Fisher Scientific	BP229
M. tuberculosis H37Rv
96孔平底白色板	康宁	3917
96孔平底透明板	康宁	3595
透明板封膜机	赛默飞世尔科技	AB-0580
光度计	应用生物系统公司	Tropix TR717