评估测试化合物对肉汤中分枝杆菌的有效性

Abstract

来源:Zheng， X.， et al. 靶向细胞内结核分枝杆菌的抑制剂的疗效和细胞毒性筛选系统。J. Vis. Exp. （2017 年）

该视频演示了一种肉汤中测定法，以确定抗生素对结核分枝杆菌的疗效。将细菌培养物与不同浓度的杀菌抗生素一起孵育。通过使用刃天青测定评估活菌的存在来衡量杀菌效果。

Protocol

1. 细菌菌株和生长培养基

1. 将 25 g 牛血清白蛋白、10.0 g 葡萄糖和 4.05 g 氯化钠溶解在 460 mL 去离子水中，制成白蛋白葡萄糖和盐储备液 （ADS）。过滤灭菌 ADS 并将其储存在 4 °C。
2. 将 4.7 克 7H9 粉末和 2 mL 甘油加入 900 mL 纯净水中，制成 7H9 肉汤。将 7H9 肉汤在 121 °C 下高压灭菌 10 分钟，并在继续之前使其冷却至室温。通过添加 100 mL ADS 和 0.5 mL Tween80 至 900 mL 7H9 肉汤制成 7H9ADST。储存在 4 °C。
3. 称取 50 mg 硫酸卡那霉素，将其溶于 1 mL 去离子水中;终浓度为 50 mg/mL。过滤灭菌并储存在 -20 °C。每 1 L 7H9ADST.
   添加 0.5 mL 卡那霉素储备溶液 注意:这种培养基应该是新鲜的，因此请根据培养物大小适当地缩放体积。
4. 在站立培养物中补充卡那霉素的 7H9ADST 中培养结核分枝杆菌。每天摇动培养物，并在 OD₆₀₀ 达到 1.0 之前稀释，以避免结块><。 注意:用于开发该方法的结核分枝杆菌菌株是用 pJAK2.A 质粒转化的 H37Rv。pJAK2.A 是一种基于 pMV361 载体的整合质粒，允许来自 hsp60 启动子的萤火虫荧光素酶基因的高水平表达，并且可以使用卡那霉素进行选择。

2. 使用刃天青分析进行肉汤内活性分析

1. 在 7H9ADST 中将结核分枝杆菌生长至对数中期 （~ 0.5 - 0.8 OD 600）。用 7H9ADST 将培养物稀释至 0.01 OD₆₀₀。将 7H9ADST 中的化合物稀释至测试浓度的 2 倍，并将 100 μL 每种稀释的化合物分装到每个孔中。
2. 将 100 μL 稀释的细菌悬浮液转移到每个孔中。让板在 37 °C 下在加湿培养箱中孵育 5 天。将 10 mg 刃天青溶解在 100 mL 去离子水和无菌过滤器中。
3. 加入 30 μL 刃天青溶液并监测 48 小时后的颜色变化;细菌生长由颜色从蓝色变为粉红色表示><。 注意:也可以通过测量 590 nm 处的荧光和 530 - 560 nm 的激发波长或 570 nm 和 600 nm 处的吸光度来进行定量分析。

Materials