在与外周血单个核细胞共培养的X射线辐照上皮细胞中测量经上皮电阻（TEER）

摘要

来源：Babini, G., 等. 一种用于研究X射线照射的Caco-2细胞与PBMC之间相互作用的共培养方法. J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了在照射后的Caco-2细胞中测量跨上皮电阻的方法，包括在有或无PBMC细胞存在条件下的实验。该方法可用于研究辐射与免疫细胞对上皮细胞屏障的协同作用。

方案

1. 照射装置设置

注意： Caco-2 细胞的照射在意大利帕维亚的意大利科学医疗研究所（IRCCS）S. Maugeri 放疗科进行，使用的是常规用于治疗多种癌症类型的直线加速器。

1. 将光子X射线能量设置为6 MV峰值。直线加速器以脉冲模式运行（两个连续脉冲之间的时间间隔约为4 ms；单个脉冲持续时间约为5 µs，剂量率可达1 × 10^-3 Gy/p）。
2. 将含有Caco-2细胞的插入式6孔板置于X射线路径上，放置于距离辐射源100 cm处、厚度为1.4 cm的Plexiglas板上（该厚度对应略大于所用辐射建成区的距离）。
3. 在照射前，在每个样品上放置一块厚度为0.5 cm的组织等效材料（bolus），以确保反向散射辐射成分及带电粒子达到平衡。
4. 使用平坦且对称（± 2%）的20 × 20 cm₂辐射野和3 Gy/min的剂量率对细胞进行照射（剂量范围为2 – 10 Gy）。
   注意： 对照组“假”照射细胞接受与照射组完全相同的处理流程，但不进入辐照室（接收剂量：0 Gy）。
   警告： 电离辐射产生装置仅可由专业人员操作。

2. 跨上皮电阻（TEER）

1. 在照射前一周，于6孔板共培养小室（聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET），2 × 10⁶ 孔/cm²）中接种5 × 10⁵ 个Caco-2细胞。
2. 照射前1小时，使用伏特计/欧姆计测量跨上皮电阻（TEER）。
3. 按照步骤1.1–1.4所述方法对细胞进行照射。
4. 将Caco-2细胞在37 °C、含5% CO₂ 的湿润气氛中培养，同时进行或不进行与外周血单个核细胞（PBMC）的共培养。
5. 照射后最初几小时内每小时测量一次TEER，之后每3小时测量一次，直至48小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于多孔板的 ThinCert 6 孔细胞培养插件	Greiner Bio-one	657610	设备
6 孔细胞培养多孔板	Greiner Bio-one	657160	塑料
24 孔细胞培养多孔板	Greiner Bio-one	662160	塑料
不含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基	Lonza	12-167F	试剂
Millicell-ERS 伏特计/欧姆计	Millipore	MERS 00001	设备