一种用于筛选抗菌剂的钉板生物膜检测法

摘要

来源：Dalecki, A. G., 等 靶向生物膜相关 金黄色葡萄球菌 使用基于刃天青的药物敏感性检测法 视频实验杂志 (2016)

本视频展示了一种利用 peg-plate 筛选能够有效清除生物膜的抗菌化合物的实验方法。该方法通过检测抗菌化合物处理后生物膜的代谢状态，从而确定最小生物膜清除浓度。

方案

1. 生物膜的起始

1. 在营养丰富的培养基中培养能够形成生物膜的微生物。从甘油保存液中接种 Staphylococcus aureus Newman 菌株至 10 ml 的 Mueller-Hinton 培养基中。所有涉及 S. aureus 的操作均需戴手套并在生物安全柜内进行。
2. 在 37 °C 条件下，以 100–200 rpm 的转速振荡培养 16 小时。
3. 使用分光光度计和标准比色皿（光程：1 cm）测定培养物在 600 nm 处的吸光度（OD₆₀₀）。
4. 根据公式 [V = 20 ml × 0.1 / OD_{600(培养物)}] 计算所需培养物体积（V），以制备 20 ml、OD_{600(接种物)} 为 0.1 的接种液，接种于经 Chelex 处理的 Roswell Park Memorial Institute 培养基（CRPMI）中。
   1. 将上述计算所得体积的培养物加入离心管中，在 10,000 × g 条件下离心 1 分钟以沉淀细胞。为制备生物膜接种液，吸除用过的培养基，将细胞沉淀重悬于 20 ml CRPMI 培养基中。
5. 将接种液倒入 25 ml 的储液槽中。
6. 小心地垂直向上提起无菌 96 孔 peg 板的盖子，将其取下。
   注意：操作时需避免污染悬挂在盖子下方的 peg 柱。可在生物安全柜内的洁净表面上将盖子倒置放置。
7. 使用 200 µl 多通道移液器，向底板 A 至 G 行的每个孔中加入 125 µl 接种液。
8. 在 H 行的每个孔中加入 125 µl 无菌 CRPMI 培养基，作为无菌对照。
9. 取下 peg 盖，将其置于底板上方，使 peg 柱朝下。小心对齐每个 peg 柱与对应的孔位，避免底板与 peg 柱发生物理接触。对齐后，缓慢将盖子放下。注意避免错位，因为一旦 peg 柱接触到底板后再进行调整，可能会污染 H 行的无菌对照孔。
10. 用石蜡膜将盖子与板密封，防止蒸发，并将整个装置放入可密封的塑料袋中，紧密封口。尽量减少袋内空气体积，以降低蒸发风险。
11. 在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中静置培养 48 小时。
    注意： 对于 S. aureus，48 小时的培养时间效果最佳，但具体时间可能因所用微生物种类而异。
    注意： 尽管静态培养是优化该检测方法的良好起点，但在微孔板摇床上以 150 rpm 轻柔振荡也是一种可行的变体方法，可能促进某些 S. aureus 分离株的生物膜形成。

2. 生物膜挑战平板的制备

1. 在进行生物膜挑战实验的当天，取一个新的96孔板，向B至H行的每个孔中加入100 µl已平衡至室温的CRPMI培养基。为避免结果不一致，应使用当插针插入时可容纳200 µl培养基、且孔的尺寸与生物膜起始板相同的96孔板。
2. 将最多4种待测化合物分别用1.0 ml CRPMI稀释至目标终浓度的2倍，以补偿步骤2.7中的最终稀释效应。
   注意：一个合适的起始浓度为浮游细胞抑制浓度的8倍。
3. 在A1至A3孔中加入200 µl化合物1，在A4至A6孔中加入化合物2，在A7至A9孔中加入化合物3，在A10至A12孔中加入化合物4。
4. 使用多通道移液器进行连续稀释，从A行向B行每孔转移100 µl，并充分混匀。
5. 依此方式逐孔转移100 µl液体，每次转移后均需混匀，直至F行停止。
6. 混匀后，将F行每孔中的100 µl液体排入废液容器中。不要向G行和H行转移任何液体。
7. 使用多通道移液器向每孔加入100 µl CRPMI，使最终体积达到200 µl。最终的板布局参见图1。

3. 生物膜挑战

1. 向一个新的无菌96孔板中加入200 µl磷酸盐缓冲液（PBS），该孔板的孔尺寸需与生物膜起始板的孔尺寸相同。
2. 从已孵育的生物膜起始板上移除塑料袋和石蜡膜。
3. 垂直向上提起盖子，避免插针与板底接触，以免损伤生物膜。保留底部板用于后续的OD₆₀₀分析（见3.8）。
4. 将带插针的盖子放入含有PBS的板中（来自步骤3.1），以洗去浮游细胞。将插针浸入PBS中5秒，取出后再浸入一次，注意不要使插针碰撞孔壁。
5. 将清洗后的带插针盖子放入挑战板中。避免插针与底板之间不必要的接触，否则会破坏生物膜，导致结果不一致。
6. 用石蜡膜密封板，并将其放入可密封的塑料袋中，操作如步骤1.10所述。
7. 将板置于37 °C、5% CO₂培养箱中静置孵育24小时。
8. 取步骤3.3中保留的生物膜起始板底部，使用多通道移液器重悬各孔中的细菌，并用合适的酶标仪测定OD₆₀₀，以确认除H行的无菌对照孔外，其余各孔均有细菌生长。

4. 生物膜测定

1. 使用配备有孵育室且能够进行动力学荧光检测的酶标仪，用于检测刃天青的转化。设置24小时动力学荧光检测程序，激发波长为530 nm，发射波长为590 nm。
2. 将孵育室温度设为37 °C，并每20分钟读取一次酶标板。根据仪器制造商的说明，设置酶标仪从酶标板底部进行检测。
3. 使用多通道移液器向无菌96孔板中加入200 µl PBS，制备洗涤板。
4. 通过将400 µl 0.8 mg/ml刃天青储备液加入20 ml CRPMI培养基中，制备生物膜回收培养基，使刃天青终浓度为16 µg/ml。
   注意：刃天青为已知皮肤刺激物，操作时应穿戴实验服、防溅护目镜和手套。选用CRPMI作为生物膜回收培养基是因为其背景信号最低，但可根据需要替换为Müller-Hinton培养基。
5. 使用多通道移液器向新的96孔板的每孔中加入150 µl生物膜回收培养基。
6. 将挑战板从孵育箱转移至生物安全柜中，小心移除塑料袋和密封膜。
7. 取下挑战板的插针盖，按照步骤3.4所述方法用PBS冲洗浮游细胞。保留挑战板底部用于后续OD₆₀₀分析（见步骤4.10）。
8. 冲洗后，将插针盖放入含有生物膜回收培养基的酶标板底部。
9. 用封口膜包裹酶标板四周，注意不要遮挡边缘孔的底部。封膜后立即把酶标板放入酶标仪中，并启动之前设定的刃天青动力学检测程序（见步骤4.1），开始为期24小时的动力学读数。
10. 为定量分析在挑战过程中可能产生或不产生的浮游细胞生长情况，使用微孔板读数仪检测整个挑战板底部的OD₆₀₀值。操作步骤请参照步骤3.8中的说明。
    注意：应小心重悬每孔中的内容物，因为从生物膜脱落的细胞倾向于在孔底成团生长。孔内任何气泡都会严重干扰OD₆₀₀读数，因此在检测前必须避免或去除。

结果

图1. 挑战试验板布局。 挑战试验板的示例布局，用于同时对四种化合物在六个不同浓度下进行三复孔测试。同时包含未处理对照组和无菌对照组。该布局设计便于使用多通道移液器在板内直接进行系列稀释的配制。浓度单位为 µM。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
穆勒-欣顿培养基	Oxoid	CM0405	遵循制造商的建议
RPMI 培养基	Corning	17-105-CV
CRPMI	参考文献 9		使用 Chelex 100 树脂对 RPMI-1640 培养基进行螯合处理 1 小时，然后添加 10% 未经螯合处理的 RPMI-1640 进行补充
Chelex 100 树脂	Bio Rad	142-2822
MBEC 板	Innovotech	19111
刃天青钠盐	Sigma	R7017	溶于去离子水中，配制成 800 µg/ml 溶液，过滤除菌
微孔板振荡平台	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 微孔板读板仪	Biotek
Gen5 软件	Biotek		用于记录和分析刃天青的转化情况
新铜试剂（Neocuproine）	Sigma	N1501	用 100% 乙醇配制成 10 mM 储存液，-80 ºC 保存
硫酸铜	Acros Organics	7758-99-8	用去离子水配制成 100 mM 储存液，4 ºC 保存
Cu-新铜试剂复合物（Cu-Neocuproine）	自制		通过将等摩尔浓度的新铜试剂与硫酸铜混合制备。将混合物用 CRPMI 培养基稀释至所需浓度。
庆大霉素	Sigma	G3632-1G