一种基于荧光的体外检测方法用于测量细胞质膜修复效率

摘要

来源：Lam, J. G.，等。哺乳动物细胞质膜修复效率的高通量测定。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种用于研究哺乳动物细胞质膜修复效率的实验方法。将细胞暴露于一种细菌性成孔毒素中，该毒素可在细胞膜上形成孔道。在细胞外钙离子存在的情况下，孔道导致钙离子内流，从而诱导细胞膜修复事件的发生。通过使用DNA结合性染料碘化丙啶来评估膜修复效率，该染料仅能进入未完成膜修复的细胞。

方案

1. 准备

1. 细胞铺板
   注意： 本方案中使用了人宫颈上皮细胞、HeLa 细胞以及表达组蛋白 2B-GFP（H2B-GFP）的 HeLa 细胞，但该检测方法可适用于其他哺乳动物细胞。
   1. 从75 cm²培养瓶中消化贴壁细胞² 用2 mL 0.25%的胰蛋白酶-EDTA洗涤细胞，对细胞进行消化。弃去使用过的胰蛋白酶，加入2 mL新鲜的0.25%胰蛋白酶-EDTA。
   2. 将细胞在37 ˚C下孵育5分钟，直至细胞变圆并从培养瓶上脱落。
   3. 将细胞重悬于8 mL培养基（含10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM）中。
   4. 使用血细胞计数板和10 µL细胞悬液测定细胞浓度。
   5. 将细胞用生长培养基稀释至浓度为 2.5 x 10⁵ cells/mL
   6. 将细胞悬液倒入无菌移液皿中，使用10 mL血清移液管充分混匀悬液。
   7. 使用12通道微量移液器和200 µL吸头，将HeLa细胞（2.5 × 10⁵）⁴ 细胞/100 µL/孔，每个样本设三个（或四个）复孔，置于96孔平底、透明底、黑色聚苯乙烯组织培养处理板中。
      注意： 一种铺板排列方式作为示例展示

结果

图1：实验设计。 流程图展示了一个代表性的孔板设计，用于检测七种测试条件相对于未处理对照细胞的效果。根据需要可加入其他对照，例如药物溶剂对照。实验前24小时将细胞接种至孔板（板1）。实验当天，用预热至37 °C的M1或M2培养基洗涤板1中的细胞，并在动力学检测前对板1进行成像（明场、GFP和PI荧光）。在成像的15分钟内，将试剂加至置于冰上的板2中。成像结束后，立即将板1置于冰上5分钟，然后从板2向板1每孔转移100 μL试剂。随后将板1放入酶标仪中，在37 °C下进行30分钟的动力学检测，之后再次成像（明场、GFP和PI荧光）。接着分析数据，统计各实验条件下的细胞数量并评估修复效率。在处理大规模数据集时，可实现分析自动化。此外，在高通量筛选中，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 成像细胞仪	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	赛默飞世尔科技	T3605
碘化丙啶	赛默飞世尔科技	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔科技	25200056
96孔康宁平底黑色聚苯乙烯组织培养处理板	康宁	3603
Hanks' 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-葡萄糖，HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG