一种基于荧光的体外检测方法用于测量细胞质膜修复效率

摘要

来源：Lam, J. G.，等。哺乳动物细胞质膜修复效率的高通量测定。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频展示了一种用于研究哺乳动物细胞质膜修复效率的实验方法。将细胞暴露于一种细菌性成孔毒素中，该毒素可在细胞膜上形成孔道。在细胞外钙离子存在的情况下，孔道导致钙离子内流，从而诱导细胞膜修复事件的发生。通过使用DNA结合性染料碘化丙啶来评估膜修复效率，该染料仅能进入未完成膜修复的细胞。

方案

1. 准备

1. 细胞铺板
   注意： 本方案中使用了人宫颈上皮细胞、HeLa 细胞以及表达组蛋白 2B-GFP（H2B-GFP）的 HeLa 细胞，但该检测方法可适用于其他哺乳动物细胞。
   1. 从75 cm²培养瓶中消化贴壁细胞² 用2 mL 0.25%的胰蛋白酶-EDTA洗涤细胞，对细胞进行消化。弃去使用过的胰蛋白酶，加入2 mL新鲜的0.25%胰蛋白酶-EDTA。
   2. 将细胞在37 ˚C下孵育5分钟，直至细胞变圆并从培养瓶上脱落。
   3. 将细胞重悬于8 mL培养基（含10%热灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM）中。
   4. 使用血细胞计数板和10 µL细胞悬液测定细胞浓度。
   5. 将细胞用生长培养基稀释至浓度为 2.5 x 10⁵ cells/mL
   6. 将细胞悬液倒入无菌移液皿中，使用10 mL血清移液管充分混匀悬液。
   7. 使用12通道微量移液器和200 µL吸头，将HeLa细胞（2.5 × 10⁵）⁴ 细胞/100 µL/孔，每个样本设三个（或四个）复孔，置于96孔平底、透明底、黑色聚苯乙烯组织培养处理板中。
      注意： 一种铺板排列方式作为示例展示 图1.
   8. 在37 ˚C、5% CO₂的湿润化细胞培养孵育箱中培养细胞24小时₂.
2. 储备液的配制
   1. 通过将95 g Hanks平衡盐溶液、0.476 g MgCl₂·6H₂O、0.486 g CaCl₂·2H₂O、10 g葡萄糖、5 g甘氨酸和2.38 g HEPES加入800 mL去离子水中，搅拌溶解，用去离子水定容至1 L，配制1 L缓冲液M的10倍浓缩储备液（用于配制M1和M2）。用NaOH将pH调节至7.4，0.22 μm滤膜过滤除菌，4°C避光保存。 缓冲液M10x，缓冲液M，Hanks平衡盐溶液，MgCl₂·6H₂O，CaCl₂·2H₂O，葡萄糖，甘氨酸，HEPES，pH调节，过滤除菌，4°C保存₂ （5 mM）和 23.83 g HEPES（100 mM）加入 900 mL 水中，调节 pH 至 7.4，加水定容至 1 L，过滤除菌。
   2. 通过将11.26 g D-(+)-葡萄糖溶于水并定容至50 mL，配制50 mL的50倍浓缩（1.25 M）葡萄糖储备液。对溶液进行过滤除菌。
   3. 通过将0.666 g CaCl₂加入水中，配制50 mL 100倍浓缩（120 mM）的钙储备液₂ 加水至总体积50 mL。过滤除菌。
   4. 配制50 mL 10倍浓度（50 mM）乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）储备液：将0.951 g EGTA加入40 mL水中，用NaOH调节pH至8以溶解EGTA，然后加水定容至50 mL。过滤除菌。
   5. 对于一个96孔板，准备50 mL M1培养基（M1，含Ca²⁺），50 mL M2培养基（M2，Ca²⁺无血清），以及15 mL添加EGTA的培养基2，相应地：
      1. 对于M1，加入5 mL的10x缓冲液M和0.5 mL的100x氯化钙₂，将1 mL 50倍浓缩葡萄糖加入43.5 mL水中。
      2. 对于M2，将5 mL的10倍浓缩M缓冲液和1 mL的50倍浓缩葡萄糖加入44 mL水中。
      3. 对于 M2/EGTA，将 1.5 mL 10x Buffer M 和 1.5 mL 10x EGTA 加入 12 mL 水中。
         注意： 所有含碘化丙啶（PI）的溶液均应在加入细胞前直接配制。
3. 酶标仪/成像细胞仪设置
   注意： 使用配备两个检测单元的多功能酶标仪：分光荧光计和成像细胞仪。限制荧光曝光以避免荧光染料发生光漂白。
   1. 将酶标仪预热至 37 °C 后再进行检测。
   2. 在“设置”模式下，根据需要为动力学检测设定相应参数：
      1. 选择 单色仪, 荧光（FL），以及 动力学 分别对应光学配置、读取模式和读取类型。
      2. 下 波长设置，分别选择9 nm和15 nm的激发和发射带通。对于使用碘化丙啶（PI）的检测，将激发波长和发射波长分别设置为535 nm和617 nm。
      3. 下方 板型，选择 96 孔板 适用于板型格式及预设的对应黑色壁透明底板的板配置。
      4. 下 读取区域，标记出将在整个动力学过程中被分析的孔。
      5. 下 PMT与光学系统，将每次读取的闪光次数预设为 6 并勾选该框 从底部开始阅读.
      6. 下 时间安排，插入 00:30:00 在 总运行时间 用于30分钟动力学测定的盒子，并插入 00:05:00 对于 间隔.
         注意：每个时间点和单一波长下，完整读取一块96孔板所需时间为30秒。
      7. 确认指定的设置 设置信息 向右并选择 好的. 按压 读取 开始动力学实验。
   3. 在“设置”模式下，根据需要设置成像参数：
      1. 选择 极小化极大算法, 成像，以及 终点 分别对应光学配置、读取模式和读取类型。
      2. 下 波长，选择 透射光，以及对应激发和发射波长为456/541 nm（GFP）和625/713 nm（PI）的荧光通道中的一个或两个。
      3. 使用相同的选项进行 板型 和 读取区域 如步骤 1.3.2.3 和 1.3.2.4 中所定义。
      4. 下 孔板区域设置选择一个孔内需要成像的位点数量。
         注：12 个位点对应一幅全孔图像。
      5. 在……之下 图像采集设置选择透射光、541（GFP）和713（PI）的曝光时间。对于GFP，以20 ms/图像的曝光时间对整个孔进行成像。对于透射光（TL）和PI荧光，分别以8 ms和20 ms的曝光时间采集每个孔中心位置的单张图像。
      6. 确认指定的设置 设置 右侧信息并选择 好的成像一块96孔板每个孔的整个表面（每孔12幅图像）并针对一个波长的采集时间约为15分钟。按下 读取 开始成像。
         注意：使用96孔板时，单波长下单幅图像/孔的采集时间约为每板2.5分钟。上述参数对应于本实验室特定设备。荧光光谱测量：采用脉冲氙灯，激发波长范围为250–850 nm，步进1.0 nm，带宽可调（9或15 nm），配备光电倍增管检测器 > 6个对数级的动态范围，以及可调节的15或25 nm发射带通。成像细胞仪：具备白光、460 nm和625 nm激发波长（带宽20 nm）的照明光源，发射滤光片中心波长分别为541 nm（带宽108 nm）和713 nm（带宽123 nm），并配备与12位125万像素电荷耦合器件相机耦合的4倍物镜。

2. 检测

注意：进行检测时，细胞融合度必须为70-90%。在洗涤步骤中，应从孔板侧壁移除和加入培养基（避免直接加在细胞上方）。在步骤3.1.5之前，需将LLO的温度保持在< 4 ˚C，以防止其发生聚集。

1. 在37 ˚C下预热的M1中配制30 µM PI储备液，在37 ˚C下预热的M2中配制30 µM PI储备液。
2. 使用12通道多通道移液器和200 µL吸头，按照以下步骤轻轻洗涤1号培养板中的细胞：
   1. 在允许修复的条件下，移除培养基，用 37 °C 预热的 M1 培养基每孔 200 µL 洗涤细胞两次。更换为每孔 100 µL 含 30 µM PI 的预热 M1 培养基。
   2. 在修复限制性条件下，移除培养基，并用 200 µL/孔含 5 mM EGTA 的温热 M2 溶液洗涤细胞一次，以螯合 Ca²⁺²⁺，随后用 200 µL/孔 M2 洗涤一次。更换为含 30 µM PI 的 100 µL/孔温热 M2 培养基。
   3. 在用含碘化丙啶的培养基清洗并替换原培养基后，直接进入步骤 2.1.3。
3. 在透射光、GFP和PI下观察1号图像板，具体步骤见1.3.3（动力学前）。此步骤耗时15–20分钟。
4. 在步骤2.1.3的15分钟期间，使用12通道多通道移液器和200 µL吸头按下述方法准备2号板：
   1. 将一个96孔圆底聚丙烯微量板置于冰上。根据对应于板1的实验设计配置该板 （图1）.
   2. 在允许修复的条件下，每孔加入100 µL含60 µM PI的冰冻M1培养基，随后每孔加入100 µL含4倍LLO的冰冻M1培养基（对照组不加）。
   3. 在限制修复的条件下，每孔加入100 µL含60 µM PI的预冷M2培养基，随后每孔加入100 µL含4倍LLO的预冷M2培养基，对照组则不加LLO。
5. 成像第1块板（步骤2.1.3）后，立即将其置于冰上，并用铝箔将板与冰隔开，避免直接接触。让第1块板冷却5分钟。
6. 使用12通道多通道微量移液器和200 µL吸头，从每个孔中转移100 µL液体至第2步1.4中所述的2号板，对应加入1号板的相应孔中。为使毒素在1号板培养基中充分分散，应将吸头插入液面以下，轻柔排液，避免产生气泡。
   注意：不要上下吹打，因为这可能会意外使细胞脱落。
7. 继续孵育1分钟，使毒素与细胞充分结合，随后立即将1号板转移至酶标仪中，使用荧光分光光度模式进行动力学检测（步骤1.3.2）。
8. 动力学检测结束时，立即使用步骤1.3.3对平板1（动力学检测后）进行成像。

3. 分析：细胞计数

1. 使用微孔板细胞计数软件，根据细胞核荧光确定细胞数量。
   1. 在设置中，选择重新分析，然后在图像分析设置的类别部分选择离散对象分析，并将寻找对象的波长设为541。
   2. 在“寻找对象”选项中，使用在图像上绘制的识别方法，在设置选项卡下选择细胞核，然后点击应用。
   3. 点击确定和读取，以启动细胞计数算法。

结果

图1：实验设计。 流程图展示了一个代表性的孔板设计，用于检测七种测试条件相对于未处理对照细胞的效果。根据需要可加入其他对照，例如药物溶剂对照。实验前24小时将细胞接种至孔板（板1）。实验当天，用预热至37 °C的M1或M2培养基洗涤板1中的细胞，并在动力学检测前对板1进行成像（明场、GFP和PI荧光）。在成像的15分钟内，将试剂加至置于冰上的板2中。成像结束后，立即将板1置于冰上5分钟，然后从板2向板1每孔转移100 μL试剂。随后将板1放入酶标仪中，在37 °C下进行30分钟的动力学检测，之后再次成像（明场、GFP和PI荧光）。接着分析数据，统计各实验条件下的细胞数量并评估修复效率。在处理大规模数据集时，可实现分析自动化。此外，在高通量筛选中，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SpectraMax i3x 多功能微孔板读板仪	Molecular Devices	i3x
MiniMax 300 成像细胞仪	Molecular Devices	5024062
TO-PRO-3	赛默飞世尔科技	T3605
碘化丙啶	赛默飞世尔科技	P3566
HeLa	ATCC	CCL2
HeLa H2B-GFP	Millipore	SCC117
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔科技	25200056
96孔康宁平底黑色聚苯乙烯组织培养处理板	康宁	3603
Hanks' 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H4891
EGTA	ISC BioExpress	0732-100G
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-(+)-葡萄糖，HybriMax	Sigma-Aldrich	G5146-1KG