一种用于检测狂犬病病毒抗原的免疫组织化学染色方法

摘要

来源：Niezgoda, M. 等，利用免疫组织化学法检测福尔马林固定组织中的丽沙病毒抗原。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了在感染小鼠脑组织中进行免疫组织化学染色以检测狂犬病病毒抗原的方法。该过程包括脱蜡和酒精处理，随后进行蛋白酶消化处理以增强抗原的可及性。免疫组织化学染色结果显示红色沉淀物，证实组织切片中存在狂犬病病毒抗原。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 组织的福尔马林固定

1. 将死后检查采集的 3-5 mm 脑组织放入 10% 磷酸盐缓冲甲醛溶液中（组织与甲醛体积比为 1:20 至 1:50），固定 24-72 小时。
   注意： 甲醛是一种有毒固定剂。
2. 记录组织的大致重量（尺寸）、组织类型（脑区）以及甲醛体积。实验室记录并保存固定时间信息至关重要。
3. 若需在甲醛固定后、处理前进行较长时间的组织保存，应将组织置于 70% 乙醇中。

2. 组织处理

1. 标本固定后，解剖组织以包含重要的脑区，例如脑干的横切面、小脑（3个叶）或海马体（双侧海马），每块组织切取厚度为3至5 mm，并放入组织处理盒中。
2. 将组织处理盒中的样本进行石蜡浸蜡处理，包埋于石蜡块中，并在切片机上切片（厚度为3至6 µm）。

3. 材料准备 / 染色皿的制备

1. 按照材料表所示设置染色缸（见图1）。向每个染色缸中加入 250 mL 溶液。
2. 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）底物储备液的配制
   1. 使用玻璃移液管将一片 20 mg 的 3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）溶解于 5 mL 的 N,N-二甲基甲酰胺中。
      注意：AEC 为致癌物。
3. 用于抗原修复的蛋白酶（例如蛋白酶K）储备液的配制
   1. 将 7 mg 蛋白酶溶解于 200 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中。
4. 洗涤缓冲液 PBS-T 的配制
   1. 将 10 mL Tween 80 加入 990 mL PBS 中，充分混匀，形成均一溶液。

4. 脱蜡和组织复水

1. 使用切片机制作5 µm厚的石蜡切片，将切片漂浮于38 ˚C的水浴中，然后转移至载玻片上。使用耐试剂笔/标记笔标记载玻片。
2. 将载玻片置于托盘中，放入55–60 ˚C的烘箱内熔蜡1小时。温度不得超过60 ˚C，以免破坏病毒抗原。
3. 从烘箱中取出载玻片，立即在三个连续的二甲苯溶液（分别置于1、2、3号容器中）中进行脱蜡，每缸5分钟。
4. 通过依次浸入浓度递减的乙醇溶液至去离子水中，对载玻片上的切片进行水化：（4至11号容器均为浸洗）4号容器：二甲苯/100%乙醇（1:1）；5号容器：100%乙醇；6号容器：100%乙醇；7号容器：95%乙醇；8号容器：95%乙醇；9号容器：80%乙醇；10号容器：70%乙醇；11号容器：去离子水（图1．容器设置）。
   注意：二甲苯为有害化学品，操作应在通风橱中进行。

5. 蛋白酶消化抗原修复

1. 在12号皿中用蛋白酶（PBS配制，2.5 µg/mL）处理切片30分钟，进行蛋白水解抗原修复。
2. 然后在PBS-T中冲洗10分钟（13号皿）。
3. 用3%过氧化氢处理10分钟（14号皿）。
4. 再次用PBS-T洗涤10分钟（15号皿）。

6. 染色步骤

1. 每次只取一张载玻片，其余载玻片保持浸没在缓冲液中（不要取出整个载玻片架——保持载玻片湿润）。取出一张载玻片，用纸巾轻轻吸去组织切片周围多余的缓冲液，注意不要扰动组织切片。将载玻片置于湿度盒中孵育，湿度盒可通过在实验台面上放置湿润的纸巾制成，在室温下用正常山羊血清（封闭）孵育15分钟。
2. 在室温下，用预先确定的最佳稀释度的一抗抗狂犬病抗体（小鼠抗狂犬病血清，1:250稀释，未发表数据）（阳性对照）以及阴性对照抗体孵育60分钟，孵育条件同上（步骤6.1），期间不进行洗涤。
3. 60分钟后，用PBS-T洗涤10分钟（第16号皿）。
4. 在湿度盒中，室温下用生物素化二抗（种属特异性）孵育15分钟（操作方式同步骤6.1）。
5. 用PBS-T洗涤10分钟（第16号皿）。
6. 在湿度盒中，室温下用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）复合物孵育15分钟（操作方式同步骤6.1）。
7. 用PBS-T洗涤10分钟（第16号皿）。
8. 在湿度盒中，室温下用过氧化物酶底物氨基乙基咔唑（AEC）孵育10分钟。AEC工作液需在使用前新鲜配制：将1 mL AEC储备液加入14 mL 0.1 M醋酸盐缓冲液（pH 5.2）中，再加入0.15 mL 3%过氧化氢（H₂O₂）。使用前用0.45 µm滤膜过滤混合液。
   注意： AEC工作液仅在2–3小时内稳定。AEC储备液可于冰箱中长期保存。
9. 用去离子水洗涤10分钟（第17号皿）。
10. 用去离子水1:2稀释的Gill苏木精染液复染2分钟（第18号皿）。
11. 用去离子水浸洗去除多余的苏木精染液（第19和20号皿）。
12. 在Scott自来水（蓝化液）中冲洗30秒（第21号皿）。
13. 用去离子水洗涤10分钟（第22号皿）。
14. 逐张取出载玻片，用水溶性封片剂封片。
15. 在光学显微镜下观察载玻片。

结果

图 1：免疫组化检测各步骤的流程图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3% 过氧化氢	Pharamacy 品牌		市售 3% H2O2
3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）	Millipore Sigma	A6926
乙酸盐缓冲液 pH 5.2	Poly Scientific R&D Corp.	s140
磷酸盐缓冲福尔马林 10%	Fisher Scientific	SF100-4	认证级
盖玻片 Corning	Fisher Scientific	12-553-471	24 × 50 mm
乙醇 190 证明	Pharmco-AAPER	111000190
乙醇 200 证明	Pharmco-AAPER	111000200
Gill 苏木精染液配方 #2	Fisher Scientific	CS401-1D
HistoMark 生物素-链霉亲和素过氧化物酶试剂盒	seracare	71-00-18	小鼠一抗
ImmunoHistoMount	Millipore Sigma	i1161	封片介质
N,N-二甲基甲酰胺 GR	Fisher Scientific	D119
磷酸盐缓冲液	HyClone	RR14440.01	0.01 M，pH 7.2（pH 7.2–7.6）
Plan-APOCHROMAT 40×/0.95 物镜	多个供应商
Plan-APOCHROMATIC 20×/0.75 物镜	多个供应商
蛋白酶 K（Pronase）	Millipore Sigma	53702	蛋白酶，来自灰色链霉菌（Streptomyces griseus）
Scott 自来水替代液	Poly Scientific R&D Corp.	s1887
Tissue-Tek 载玻片染色套装	Fisher Scientific	50-294-72
TWEEN-80	Millipore Sigma	P1754
二甲苯	Fisher Scientific	X3S-4	组织学级
蔡司 Axioplan 2 成像显微镜	多个供应商