免疫组织化学法研究巨噬细胞与浸润免疫细胞之间的关系

摘要

来源：Albano-Aluquin, S. 等，叶酸受体β巨噬细胞及血管免疫微环境在巨细胞动脉炎中的免疫组织病理学研究。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种用于量化颞动脉活检组织中巨噬细胞占总浸润免疫细胞群体相对比例的技术。通过对受自身免疫性疾病影响的组织切片进行免疫组织化学染色，可特异性地标记具有特定受体的免疫细胞，从而在视觉上将其与其他细胞区分开来。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 获取颞动脉活检后的组织病理学制备与处理

注意： 颞动脉活检（TAB）由认证外科医生在局部麻醉和无菌条件下进行。手术取材时，从病变较重的一侧获取一段长约3 cm的动脉组织，立即用福尔马林固定24小时，随后切成3至4 mm的小段，包埋于石蜡中，并注意确保组织在蜡块中的正确方向，之后在室温下保存。在确认病历资料后进行标本选择。诊断依据为美国风湿病学会1990年标准，该标准要求受试者满足以下5项指标中的至少3项：年龄>50岁、新发头痛、颞动脉压痛、魏氏法测得红细胞沉降率>50 mm/小时，以及异常的颞动脉活检结果。 出于安全考虑，处理标本、化学试剂和抗体时必须始终佩戴防护手套。

1. 使用切片机从包埋块中切下4-5 µm厚的切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。选用选定的正常组织对照切片以确保质量。
2. 将切下的切片漂浮于40 °C的温水浴中以去除皱褶，然后用涂覆过的玻璃载玻片捞取。  将载玻片置于60 °C烘箱中的加热板上，加热60分钟，以促进切片干燥并牢固附着于载玻片上。
3. 将载玻片置于60 °C烘箱中的加热板上，加热60分钟，以促进切片干燥并牢固附着于载玻片上。
4. 将3个切片固定在显微镜载玻片上。
5. 将载玻片放入垂直放置的染色架中，在37 °C下干燥过夜，持续24小时。
6. 将载玻片放入容器中，并在4 °C下保存。

2. 免疫组织化学制备、脱蜡、 抗原修复与染色

1. 将切片放入切片架中。按以下步骤将切片架依次通过各试剂皿：在100%二甲苯中浸洗两次，每次5分钟，每30秒轻轻振荡10秒；随后依次在100%乙醇、90%乙醇、70%乙醇中各浸洗一次，每次振荡10秒；最后在重蒸水中浸洗两次，每次5分钟。₂O，振荡10秒。        
   注意： 二甲苯和丙酮的操作应在通风橱中进行，以避免吸入导致的呼吸系统毒性。
2. 将染色架转移至含有200 mL预热至95 °C的10 mmol/L、pH 6.0柠檬酸缓冲液的玻璃容器中进行抗原修复。在水浴中孵育30分钟，随后于室温冷却20分钟，再用流水冲洗5分钟。
3. 通过在200 mL 3%过氧化氢溶液中孵育10分钟，去除内源性过氧化物酶活性。用200 µL Tris缓冲盐水溶液（TBSS）洗涤载玻片3次。
4. 从染色架上取下载玻片，轻轻拍打每张玻片以吸去多余的缓冲液。进行染色时，每张载玻片上加入 200 µL 下列一抗，盖上盖玻片，置于湿盒中室温孵育 1 小时：
   抗叶酸受体β（FRB）抗体按1:800稀释  
   单克隆小鼠抗人 CD68 抗体，1:200 稀释  
   多克隆兔抗 CD3 抗体，1:100 稀释
   注意： 胎盘的福尔马林固定石蜡包埋切片也按照步骤2.1至2.9所述进行处理，并与抗FRB18抗体孵育，作为阳性对照。染色结果通过确定最佳抗体浓度获得，该浓度通过抗体的倍比稀释（如1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600）滴定确定。
5. 孵育结束后取下盖玻片并弃去。用 TBSS 缓冲液冲洗载玻片，每次 2 分钟，共冲洗 3 次，沥干并擦去多余缓冲液。
6. 加入200 µL含生物素标记的抗兔/鼠二抗溶液，以与组织抗原结合的未标记一抗发生反应。将盖玻片置于载玻片上，于室温下在湿盒中孵育45分钟。
7. 孵育结束后移除盖玻片并弃去。用 TBS 缓冲液冲洗载玻片 3 次，每次 2 分钟，沥干后吸去多余缓冲液。
8. 加入200 µL二氨基联苯胺（DAB）+底物缓冲液（咪唑盐酸）-发色系统，孵育10分钟以显色。用TBSS洗涤，然后用流动的自来水冲洗10分钟。
9. 用苏木精复染3分钟。
10. 滴加70 µL封片剂至载玻片表面，将盖玻片缓慢倾斜覆盖在封片剂上，避免产生气泡。室温静置24小时使其充分干燥。 

3. 组织病理学与免疫组织化学（IHC）分析

使用光学显微镜观察巨细胞动脉炎阳性患者和正常受试者的H&E染色及免疫组化染色切片。

1. 对于 H&E 染色切片
   1. 评估血管结构，识别内膜中的内皮细胞、中膜中的平滑肌细胞，以及外膜中的成纤维细胞和血管滋养血管。
   2. 识别巨细胞动脉炎（GCA）的特征，包括淋巴细胞和巨噬细胞/组织细胞浸润、细胞增生以及内弹性膜降解。
   3. 通过识别并量化巨噬细胞相对于淋巴细胞的数量，分析淋巴组织细胞浸润情况；评估内弹性膜破坏程度以及 resident 细胞的增生性改变，并与对照组进行比较。
2. 对于免疫组化（IHC）染色切片
   1. 观察 FRB 的染色模式，注意其在特定类型细胞中的表达情况，以及其在血管各层中的分布，同时分析其与总免疫细胞浸润、总巨噬细胞标志物抗 CD68 和全淋巴细胞标志物抗 CD3 的关系。
   2. 通过计数 10 个随机选取的高倍视野（hpf）中阳性染色的 FRB、CD68 和 CD3 细胞数量，量化其表达水平，并记录平均值。
      注意： 这些正常与病变细胞及结构的鉴定由认证的心血管病理学家和风湿病学家完成，所有病例的结果均已记录。
   3. 使用数码相机采集代表性图像。
      注意： 完成上述步骤后，剩余样品 aliquot 可储存于 -80 °C。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
切片机	Reichert-Jung
普通和磨砂载玻片及盖玻片	Fisher Scientific
垂直支架	Fisher Scientific
光学显微镜	Olympus BX60 microscope
二甲苯
蒸馏水中的丙酮			浓度分别为 100%、90%、70%
Tris缓冲盐溶液（TBS）	Dako Wash BufferS3006
含3%过氧化氢的TBS溶液
二氨基联苯胺（DAB）	Sigma Fast Tablet set
Chemical Permount 封片介质	Fisher Scientific	SP-15-100
Harleco Gill's III 苏木精染液	Fiisher Scientific 23-750-019
Harleco Eosin Y 1% 醇储备液	Fisher Scientific	23-749-977
10 mM 柠檬酸一水合物（pH 6.0）
多克隆兔抗叶酸受体β	Manohar Ratnam		最佳稀释比例为1:800
单克隆小鼠抗人CD68抗体	Dako	M071801	最佳稀释比例为1:200
多克隆兔抗CD3抗体	Agilent Dako	A0452	最佳稀释比例为1:100
聚合物山羊抗兔/鼠二抗	Dako
胎盘组织			作为FRB阳性对照