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所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。
1. 组织收获和紫外线交联
- 使用二氧化碳 （CO2） 对 2 只成年小鼠实施安乐死 1-2 分钟或直到呼吸停止。接下来，对每只小鼠进行颈椎脱位。
- 对于每个免疫沉淀实验，从适当年龄的小鼠（本研究中为一个成年睾丸）收获约 100 毫克睾丸，并将组织置于冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中。
- 用一对细尖镊子轻轻去除白膜。
- 在组织研磨机中加入 3 mL 冰冷的 PBS，并使用松散的玻璃杵（A 型玻璃杵）通过轻微的机械力研磨组织><。
注意:此步骤的目的不是裂解细胞，而是拉开组织。保持细胞活力和完整性很重要。
- 将组织悬液转移至细胞培养皿（直径 10 cm）中，并加入冰冷的 PBS 至 6 mL。
- 快速摇晃盘子，使液体均匀地覆盖盘子底部。如果组织研磨得当，将可以看到均匀分布的生精小管，而组织团块的存在表明组织分散性不理想。
- 在冰上以 400 mJ/cm2 在 254 nm 处交联悬浮液 3 次。在每次照射之间混合悬浮液。
注意:对于每个新实验，应优化交联。
- 将悬浮液收集在 15 mL 锥形管中，并在 4 °C 下以 1,200 x g 的离心力沉淀 5 分钟。去除上清液，将沉淀重悬于 1 mL PBS 中，然后将悬浮液转移到 1.5 mL 离心管中。在 4 °C 和 1,000 x g 下旋转 2 分钟，然后去除上清液。
- 此时，立即进行方案的其余部分，或在液氮中快速冷冻沉淀并将其储存在 -80 °C 直至使用。
2. 珠子的制备
- 将每个样品（沉淀）中的 125 μL 蛋白 A 磁珠添加到新鲜的离心管中><。
注意: 将蛋白 G 磁珠用于小鼠抗体。
- 将试管放在磁铁上，将珠子与溶液分离。10 秒后，去除上清液。用 1 mL 冰冷的裂解缓冲液洗涤珠子两次。
注意:随后分离蛋白 A 磁珠的步骤如下。裂解缓冲液成分为 50 mM Tris-HCl，pH 7.5;100 毫米氯化钠;1% NP-40;0.1% SDS;0.5% 脱氧胆酸钠;1/50 不含乙二胺四乙酸 （EDTA） 的蛋白酶抑制剂混合物（新鲜添加）。
- 用 10 μg eCLIP 抗体在 100 μL 冷裂解缓冲液中重悬磁珠。在室温下旋转试管 45 分钟
注意:免疫沉淀的最终抗体浓度为 10 μg/mL。如果抗体浓度未知，则应优化抗体量。
- 用 1 mL 冰冷的裂解缓冲液洗涤珠子两次。
3. 组织裂解和部分 RNA 消化
- 将组织沉淀重悬于 1 mL 冷裂解缓冲液中（向 1 mL 裂解缓冲液中加入 22 μL 不含 50x （EDTA） 的蛋白抑制剂混合物和 11 μL RNase 抑制剂）。
- 每组实验重悬两个 UV 交联沉淀和两个非交联沉淀:用于 eCLIP 文库的 UV 交联-1 沉淀 （UV-1）;用于 eCLIP 文库的 UV 交联-2 沉淀 （UV-2）;用于 eCLIP 文库的非交联-1 沉淀作为对照（非 UV）;用于 IgG IP 的非交联 2 沉淀物，以证明抗体的特异性。
注意: UV 交联宽型睾丸的 eCLIP 文库的理想对照是来自同一窝小鼠的 UV 交联敲除睾丸。
- 将样品在冰上继续裂解 15 分钟（以防止蛋白质和 RNA 降解）。
- 在数字超声仪中以 10% 振幅超声处理 5 分钟，开 30 秒/关 30 秒。始终将样品放在冰上，并在每个样品之间用不含核酸酶的水清洁探针。
- 向每个试管中加入 4 μL DNase，并充分混合。在 37 °C 下孵育 10 分钟，以 1,200 rpm 振荡。
- 加入 10 μL 稀释的 RNase I（4 U/μL RNase I 的 PBS 溶液），并充分混合。在 37 °C 下孵育 5 分钟，以 1,200 rpm 的速度摇动。
- 通过以 15,000 x g 离心 20 分钟（在 4 °C）来澄清裂解物。
- 小心收集上清液。留下 50 μL 裂解物，并丢弃沉淀物。
- 将输入样品保存为 RWB（运行用于 western blot）和 RRI（运行用于 RNA 分离）。节省 20 μL （2%） 的 UV-1、UV-2、非 UV 和 IgG 样品作为 RWB 凝胶上样的起始量。保存 20 μL （2%） 的 UV-1 或 UV-2 样品作为 RRI 凝胶上样的起始量。
4. 免疫沉淀
- 向珠子（在第 2 部分中制备）中加入 1 mL 裂解物（来自步骤 3.7），并将样品在 4 °C 下旋转 2 小时或过夜。
- 用磁力架收集珠子并丢弃上清液。用 900 μL 高盐缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5;1 M NaCl;1 mM EDTA;1% NP-40;0.1% SDS;0.5% 脱氧胆酸钠）洗涤珠子两次，然后用 900 μL 洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5;10 mM MgCl2;0.2% Tween-20）洗涤珠子两次><。
注意:对于 IgG 样品，请在此处暂停程序并将其储存在洗涤缓冲液中的冰上。