一种改进的交联免疫沉淀方法用于高效鉴定小鼠睾丸中与蛋白质结合的RNA

摘要

来源：Xu, Q., 等 用于高效鉴定小鼠睾丸中蛋白质结合RNA的增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法。J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法，用于鉴定小鼠睾丸中的RNA结合蛋白。eCLIP能够精确定位RNA结合蛋白（RBPs）与其靶RNA相互作用的结合位点。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 组织收获与紫外交联

1. 使用二氧化碳（CO₂）安乐死2只成年小鼠，持续1-2分钟或直至呼吸停止。随后对每只小鼠实施颈椎脱位。
2. 从适当年龄的小鼠（本研究中为一只成年小鼠的睾丸）收集约100 mg睾丸组织，用于每次免疫沉淀实验，并将组织置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
3. 用一对尖头镊子轻轻去除白膜。
4. 在组织研磨器中加入3 mL冰上预冷的PBS，使用松配合玻璃研杵（A型玻璃研杵）通过轻柔的机械力研磨组织。
   注意：此步骤的目的不是裂解细胞，而是将组织分散开。保持细胞活力和完整性至关重要。
5. 将组织悬液转移至细胞培养皿（直径10 cm），并加入冰上预冷的PBS至总体积6 mL。
6. 快速振荡培养皿，使液体均匀覆盖皿底。若组织研磨充分，可见均匀分布的曲细精管；若存在组织团块，则表明组织分散效果不理想。
7. 将悬液置于冰上，于254 nm波长下以400 mJ/cm²剂量交联三次，每次照射之间混匀悬液。
   注意：每次新实验均应优化交联条件。
8. 将悬液收集至15 mL锥形离心管中....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体
Anti-mouse MOV10 antibody	Proteintech, 中国	10370-1-AP
Anti-mouse MOV10L1 antibody	Zheng et al.20109	polyclonal antisera UP2175
HRP Goat Anti-Rabbit IgG	ABclonal	AS014
Rabbit IgG	Beyotime, 中国	A7016
设备	Eppendorf, 汉堡, 德国	5242R
数字超声破碎仪	BRANSON, 美国	BBV12081048A
DynaMag-2 磁力架	Invitrogen, 美国	12321D
紫外交联仪	UVP, 美国	CL-1000
材料
离心管	Corning, 美国	430791
微量离心管	AXYGEN, 美国	MCT-150-C	1.5 mL
试剂
酸性酚/氯仿/异戊醇	Solarbio, 中国	P1011	25:24:01
AffinityScript 酶	Agilent, 美国	600107
RNase I	Invitrogen, 美国	AM2295
RNase 抑制剂	Promega, 美国	N251B
RQ1 DNase	Promega, 美国	M610A
样品还原剂	Invitrogen, 美国	NP0009
SDS 溶液	Invitrogen, 美国	15553027	10%