来源：Xu, Q., 等 用于高效鉴定小鼠睾丸中蛋白质结合RNA的增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法。J. Vis. Exp. (2019)
本视频演示了增强型交联免疫沉淀（eCLIP）方法，用于鉴定小鼠睾丸中的RNA结合蛋白。eCLIP能够精确定位RNA结合蛋白（RBPs）与其靶RNA相互作用的结合位点。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
一种改进的交联免疫沉淀方法用于高效鉴定小鼠睾丸中与蛋白质结合的RNA
916 次观看
⸱
2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 组织收获与紫外交联
- 使用二氧化碳（CO2）安乐死2只成年小鼠，持续1-2分钟或直至呼吸停止。随后对每只小鼠实施颈椎脱位。
- 从适当年龄的小鼠（本研究中为一只成年小鼠的睾丸）收集约100 mg睾丸组织，用于每次免疫沉淀实验，并将组织置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 用一对尖头镊子轻轻去除白膜。
- 在组织研磨器中加入3 mL冰上预冷的PBS，使用松配合玻璃研杵（A型玻璃研杵）通过轻柔的机械力研磨组织。
注意：此步骤的目的不是裂解细胞，而是将组织分散开。保持细胞活力和完整性至关重要。 - 将组织悬液转移至细胞培养皿（直径10 cm），并加入冰上预冷的PBS至总体积6 mL。
- 快速振荡培养皿，使液体均匀覆盖皿底。若组织研磨充分，可见均匀分布的曲细精管；若存在组织团块，则表明组织分散效果不理想。
- 将悬液置于冰上，于254 nm波长下以400 mJ/cm2剂量交联三次，每次照射之间混匀悬液。
注意：每次新实验均应优化交联条件。 - 将悬液收集至15 mL锥形离心管中，在4 °C、1,200 × g条件下离心5分钟以收集沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL PBS中，然后转移至1.5 mL离心管。在4 °C、1,000 × g条件下离心2分钟，弃去上清液。
- 此时可立即进行后续实验步骤，或将沉淀在液氮中速冻后于-80 °C保存备用。
2. 磁珠制备
- 每份样品（沉淀）加入 125 µL 蛋白 A 磁珠至新的离心管中。
注意：针对小鼠抗体，请使用蛋白 G 磁珠。 - 将离心管置于磁力架上，使磁珠与溶液分离。10 秒后吸除上清液。用 1 mL 冰冷裂解缓冲液洗涤磁珠两次。
注意：后续蛋白 A 磁珠的分离均按此步骤进行。裂解缓冲液成分为：50 mM Tris-HCl，pH 7.5；100 mM NaCl；1% NP-40；0.1% SDS；0.5% 脱氧胆酸钠；1/50 体积的不含乙二胺四乙酸（EDTA）的蛋白酶抑制剂混合物（现配现加）。 - 将磁珠重悬于含 10 µg eCLIP 抗体的 100 µL 冷裂解缓冲液中。室温下旋转孵育 45 分钟。
注意：免疫沉淀的最终抗体浓度为 10 µg/mL。若抗体浓度未知，应优化抗体使用量。 - 用 1 mL 冰冷裂解缓冲液洗涤磁珠两次。
3. 组织裂解与部分RNA消化
- 将组织沉淀重悬于 1 mL 冷裂解缓冲液中（向 1 mL 裂解缓冲液中加入 22 µL 50x (EDTA)自由蛋白酶抑制剂混合物和 11 µL RNase 抑制剂）。
- 每组实验分别重悬两个紫外交联沉淀和两个非交联沉淀：紫外交联-1 沉淀用于 eCLIP 文库（UV-1）；紫外交联-2 沉淀用于 eCLIP 文库（UV-2）；非交联-1 沉淀作为对照用于 eCLIP 文库（non-UV）；非交联-2 沉淀用于 IgG 免疫沉淀以验证抗体的特异性。
注意：针对紫外交联野生型睾丸 eCLIP 文库的理想对照，应来自同窝小鼠的紫外交联基因敲除型睾丸。
- 每组实验分别重悬两个紫外交联沉淀和两个非交联沉淀：紫外交联-1 沉淀用于 eCLIP 文库（UV-1）；紫外交联-2 沉淀用于 eCLIP 文库（UV-2）；非交联-1 沉淀作为对照用于 eCLIP 文库（non-UV）；非交联-2 沉淀用于 IgG 免疫沉淀以验证抗体的特异性。
- 将样品置于冰上裂解 15 分钟（以防止蛋白质和 RNA 降解）。
- 使用数字超声仪以 10% 振幅超声处理 5 分钟，工作与间歇时间为 30 秒开/30 秒关。每次处理之间始终将样品置于冰上，并用无核酸酶水清洗探头。
- 向每管中加入 4 µL DNase，充分混匀。在 37 °C 下孵育 10 分钟，以 1,200 rpm 振荡。
- 加入 10 µL 稀释后的 RNase I（PBS 中含 4 U/µL RNase I），充分混匀。在 37 °C 下孵育 5 分钟，以 1,200 rpm 振荡。
- 在 4 °C 下以 15,000 x g 离心 20 分钟，澄清裂解液。
- 小心收集上清液。保留 50 µL 裂解液并连同沉淀一起弃去。
- 保存输入样品用于 RWB（用于 Western 印迹）和 RRI（用于 RNA 提取）。将 UV-1、UV-2、non-UV 和 IgG 样品各取 20 µL（2%）作为输入样品用于 RWB 凝胶上样。将 UV-1 或 UV-2 样品取 20 µL（2%）作为输入样品用于 RRI 凝胶上样。
4. 免疫沉淀
- 取1 mL裂解液（来自步骤3.7）加入到磁珠中（来自第2节的制备），在4 °C下旋转孵育2小时或过夜。
- 将样品置于磁力架上收集磁珠，弃去上清液。用900 µL高盐缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5；1 M NaCl；1 mM EDTA；1% NP-40；0.1% SDS；0.5%脱氧胆酸钠）洗涤磁珠两次，随后用900 µL洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5；10 mM MgCl₂；0.2% Tween-20）再洗涤两次。
注意：对于IgG样品，可在本步骤暂停操作，将磁珠置于洗涤缓冲液中并在冰上保存。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | |||
| Anti-mouse MOV10 antibody | Proteintech, 中国 | 10370-1-AP | |
| Anti-mouse MOV10L1 antibody | Zheng et al.20109 | polyclonal antisera UP2175 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG | ABclonal | AS014 | |
| Rabbit IgG | Beyotime, 中国 | A7016 | |
| 设备 | Eppendorf, 汉堡, 德国 | 5242R | |
| 数字超声破碎仪 | BRANSON, 美国 | BBV12081048A | |
| DynaMag-2 磁力架 | Invitrogen, 美国 | 12321D | |
| 紫外交联仪 | UVP, 美国 | CL-1000 | |
| 材料 | |||
| 离心管 | Corning, 美国 | 430791 | |
| 微量离心管 | AXYGEN, 美国 | MCT-150-C | 1.5 mL |
| 试剂 | |||
| 酸性酚/氯仿/异戊醇 | Solarbio, 中国 | P1011 | 25:24:01 |
| AffinityScript 酶 | Agilent, 美国 | 600107 | |
| RNase I | Invitrogen, 美国 | AM2295 | |
| RNase 抑制剂 | Promega, 美国 | N251B | |
| RQ1 DNase | Promega, 美国 | M610A | |
| 样品还原剂 | Invitrogen, 美国 | NP0009 | |
| SDS 溶液 | Invitrogen, 美国 | 15553027 | 10% |
