一种用于抗原特异性CD8+ T细胞细胞周期分析的检测方法

摘要

来源：Simonetti, S., 等 基于DNA/Ki67的流式细胞术检测方法用于分析疫苗接种小鼠中抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了一种用于分析处于不同细胞周期阶段的抗原特异性CD8⁺ T细胞的检测方法。通过流式细胞术选择荧光标记的活细胞，并利用针对细胞增殖相关核蛋白的抗体及核酸染料，根据DNA含量鉴定处于不同细胞周期阶段的细胞。

方案

1. 培养基与染色液的制备

1. 配制完全培养基：含 2 mM 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素/链霉素、50 µM β-巯基乙醇以及 10% 体积比（v/v）胎牛血清（FBS）的 RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基
2. 配制染色缓冲液：不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的磷酸盐缓冲液（PBS），添加 1% 质量体积比（w/v）牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）

2. 小鼠处理

1. 使用表达人免疫缺陷病毒（HIV）-1-gag的黑猩猩腺病毒载体（ChAd3-gag），以每只10⁷个病毒颗粒的剂量，通过股四头肌肌肉注射（i.m.）对7-8周龄雌性Balb/c小鼠进行初次免疫。
2. 初次免疫后1-4个月，通过肌肉注射（i.m.）给予表达HIV-1-gag的改良安卡拉痘苗病毒（MVA-gag），每只10⁶个空斑形成单位，对小鼠进行一次加强免疫。
3. 加强免疫后第3天，通过颈椎脱位法处死加强免疫的小鼠，并与未处理小鼠平行开展分析。
4. 采集加强免疫组和未处理组小鼠股四头肌引流的淋巴结（LN）（包括髂淋巴结、腘淋巴结和腹股沟淋巴结）以及脾脏。此外，从未处理小鼠的两条后肢收集骨髓（BM），并将该骨髓用于流式细胞仪参数设置以及作为细胞周期分析的阳性对照（图1）。
   注意：ChAd3-gag和MVA-gag载体的制备方法参见先前文献。

3. 引流淋巴结和脾脏的分离

1. 脾脏和淋巴结细胞的分离
   1. 在两个15 mL离心管中各加入5 mL完全培养基，并置于冰上预冷，以备收集器官。
   2. 通过颈椎脱位法处死一只成年小鼠。
   3. 将小鼠仰卧放置，并用70%（v/v）乙醇对皮肤表面进行消毒。
   4. 为收集腹股沟淋巴结，用剪刀在腹部做一条约1 cm的纵向切口，并用镊子将切口撑开。
   5. 在皮肤内侧表面观察腹股沟淋巴结，并用镊子将其取出。将腹股沟淋巴结放入步骤3.1.1中准备好的两个15 mL离心管之一中。
   6. 为收集脾脏，用剪刀切开腹腔并取出脾脏。剪除周围结缔组织后，将脾脏放入步骤3.1.1中准备好的第二个15 mL离心管中。
   7. 为收集髂淋巴结，将肠道移开，观察靠近下腔静脉的髂淋巴结，然后用镊子将其采集。将髂淋巴结放入与腹股沟淋巴结相同的离心管中。
      ​注意：为了获得足够数量的淋巴结细胞用于染色（见第4部分），通常需要合并一只小鼠的腘窝、腹股沟和髂淋巴结。这些淋巴结均引流股四头肌区域（肌肉注射免疫的部位）。本方案仅使用一个含有合并淋巴结的15 mL离心管。
   8. 为收集腘窝淋巴结，抓住后肢皮肤并轻轻向下拉，以暴露肌肉组织。然后将镊子插入膝关节下方的肌肉之间，采集腘窝淋巴结。将腘窝淋巴结放入与腹股沟和髂淋巴结相同的离心管中。
      ​注意：参见3.1.7步骤后的说明。
   9. 将脾脏置于装有5 mL完全培养基的60 mm培养皿中的70 µm细胞筛网上。使用5 mL注射器的推杆轻轻研磨组织，直至完全解离。
   10. 移除细胞筛网，将细胞悬液转移至一个洁净的15 mL离心管中。
   11. 向培养皿中加入5 mL完全培养基，仔细冲洗培养皿和筛网，确保所有细胞均被回收。将冲洗液合并至含有脾细胞悬液的15 mL离心管中。
   12. 对于合并的腹股沟、髂和腘窝淋巴结，参照步骤3.1.9至3.1.11处理脾脏的方法，制备单细胞悬液。
   13. 在4 °C条件下，以400 × g离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于PBS中。
   14. 使用红细胞裂解缓冲液和PBS中含0.04%（v/v）台盼蓝，通过血球计数板对细胞进行计数。

4. 脾脏、淋巴结的染色​

1. 将待染色的细胞样品分为3个亚组： 用于补偿的细胞样本包括未经处理小鼠的骨髓细胞，仅用 Hoechst 33342 染色（下文简称 Hoechst），以及未经处理小鼠的脾细胞，用于制备死/活细胞混合物以进行死细胞染料补偿； 细胞周期分析的阳性对照，包括来自未经处理的小鼠的骨髓样本； 实验样本 包含未治疗和已接种疫苗小鼠的脾脏和淋巴结样本。
   注意： 确保有足够的脾脏和淋巴结细胞，以分析到足够数量的gag特异性CD8 T细胞。通常需要合并3只免疫小鼠的脾脏细胞和淋巴结细胞，并对两份或更多相同的细胞混合样本进行染色，每份样本含有3 × 10⁶ 细胞。在Hoechst染色步骤合并相同的样品。同样，对来自3只未处理小鼠的脾细胞和淋巴结细胞进行染色，并在最后合并相同的样品。留出一部分 未染色样品 用于仪器设置和补偿调节的未经处理小鼠的脾细胞
2. 制备死/活细胞混合物用于死细胞染料补偿（该细胞混合物仅用死细胞染料染色）。
   1. 将水浴加热至 65 °C。
   2. 取一份脾细胞（约 3 × 10⁶).
   3. 将细胞悬液转移至微量离心管中，置于65 °C水浴中5 min，然后立即置于冰上10 min。
   4. 将热灭活的细胞与活的脾细胞（约 3 × 10⁶) 按1:1比例混合，取一半混合物转移至96孔圆底板（约3 × 10⁶ 每孔细胞数（用于死细胞染色对照）
3. 实验样本的死细胞染色、细胞周期分析的阳性对照以及死/活细胞混合物
   1. 转移脾脏、淋巴结、骨髓细胞（3 × 10⁶ 细胞/孔）以及死/活细胞混合物（第4.2节）按照染色方案（步骤4.1）加入96孔圆底板中，并于400 × g 4 °C下离心3分钟。
   2. 将每个细胞沉淀重悬于50 µL用PBS稀释的死细胞染料中，并立即通过移液吹打3次使其重悬。
   3. 4 °C 避光孵育 30 分钟。
   4. 用染色缓冲液洗涤细胞2次，第一次加入200 µL，第二次加入250 µL；每次洗涤均以400 × g离心培养板 g 4 °C下，3分钟。
   5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于20 µL PBS中。
4. 使用主要组织相容性复合物（MHC）-肽多聚体和单克隆抗体（mAbs）对细胞膜进行染色。
   1. 根据染色方案（流式细胞仪设置）考虑所需的必要体积， 表1），准备以下试剂：
      1. 根据适当的稀释比例，将 mAb 2.4G2 用染色缓冲液稀释（参见 材料表）；每份待染色样品使用10 µL该稀释液。
         注意： 2.4G2 单克隆抗体可阻断免疫球蛋白通过 FcγIII 和 FcγII 受体发生的非抗原特异性结合。
      2. 将 H-2k(d) AMQMLKETI 别藻蓝蛋白（APC）标记的四聚体（Tetr-gag）用染色缓冲液稀释至适当浓度（参见 材料表）；每份待染色样品使用20 µL该稀释液。
      3. 按照适当的稀释比例，将单克隆抗体（mAbs）在染色缓冲液中稀释，配制抗体混合液（参见 材料表在滴定实验中已预先确定的抗体混合物；每份待染色样品使用 20 µL 该抗体混合物。
         注意： 此处使用了抗CD3e藻红素-叶绿素蛋白-花青素5.5（PerCP-Cy5.5）（克隆号145-2C11）、抗CD8a brilliance紫外荧光染料805（BUV805）（克隆号53-6.7）以及抗CD62L藻红蛋白-花青素7（PECy7）（克隆号MEL-14）。
   2. 加入10 µL先前稀释的2.4G2单克隆抗体（步骤4.4.1.1），4 °C避光孵育10分钟。
   3. 加入20 µL先前稀释的Tetr-gag APC（步骤4.4.1.2）和10 µL H-2k(d) AMQMLKETI藻红蛋白（PE）五聚体（pent-gag）。4 °C避光孵育15分钟。
   4. 加入20 µL预先配制的抗体混合液（步骤4.4.1.3），在4 °C避光孵育15分钟。
      注意： 因此，每孔最终体积为 80 µL（步骤 4.3.5，步骤 4.4.2 至 4.4.4）。
   5. 用 200 µL 染色缓冲液洗涤细胞。在 400 × g 4 °C下离心5分钟。
   6. 将细胞沉淀重悬于250 µL染色缓冲液中，转移细胞悬液至5 mL离心管。向管中加入1 mL染色缓冲液，400 × g 4 °C下离心5分钟。
   7. 取骨髓细胞等分试样（3 × 10⁶ 细胞）（参见第4.1节细胞样本列表），用于补偿Hoechst通道（Hoechst 33342由紫外激光激发（流式细胞仪设置（表2)), 并将细胞悬液转移至一个5 mL离心管中。向管中加入1 mL染色缓冲液，以400 × g 4 °C下离心5分钟。

5. 固定/透化

1. 根据制造商说明书，将1份固定/破膜浓缩液与3份固定/破膜稀释液混合，新鲜配制固定/破膜缓冲液。
2. 弃去上清液，短暂涡旋振荡样品，彻底分散沉淀物。
3. 向每支试管中加入1 mL新鲜配制的固定/破膜缓冲液，包括一支含有未染色脾细胞的试管（3 × 10⁶，见细胞样品列表，第4.1节），然后涡旋振荡。
4. 在4 °C下孵育16小时。
   注意：本方案可在此处暂停。

6. 胞内染色

1. Ki67 染色
   1. 根据制造商说明书，用去离子水将 10× 破膜缓冲液稀释为 1× 破膜缓冲液。使用前，必须将 1× 破膜缓冲液经 0.45 μm 滤膜过滤，以去除聚集体。
   2. 将 Ki67 单克隆抗体-异硫氰酸荧光素（FITC）（克隆号 SolA15）用 1× 破膜缓冲液稀释（参见材料表），稀释比例依据前期滴定实验确定（每样本终体积为 100 μL）。
   3. 向每管中加入 3 mL 1× 破膜缓冲液，在室温（RT）下以 400 × g 离心 5 分钟。
   4. 弃去上清液，重复步骤 6.1.3。
   5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 100 µL 已预先稀释的 Ki67 单克隆抗体-FITC 溶液中（见步骤 6.1.2）。
   6. 在室温下避光孵育 30 分钟。
   7. 用 4 mL 1× 破膜缓冲液洗涤细胞两次，每次在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。
   8. 根据以下体积将细胞沉淀重悬于 PBS 中：需直接上流式细胞仪检测的样本，加入 350 µL PBS；需在流式细胞术前短时间孵育 Hoechst 的样本（见第 6.2 节），加入 250 µL PBS。
2. DNA 染色
   1. 向每个样本中加入 250 µL 含 4 µg/mL Hoechst 的 PBS 溶液（Hoechst 终浓度为 2 µg/mL）。
      ​​注意：若已制备两份或以上各 250 µL 的 PBS 样本，可在本步骤合并，并加入等体积的 4 µg/mL Hoechst PBS 溶液（Hoechst 终浓度为 2 µg/mL）。细胞数量对 DNA 染色步骤影响显著。每个样本应使用相同数量的细胞。需注意，即使细胞数量略有减少（例如因前期洗涤步骤中细胞丢失），也会导致 Hoechst 与 DNA 的结合增加，从而引起 Hoechst 荧光强度升高。
   2. 在室温下避光孵育 15 分钟。
   3. 在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。
   4. 将细胞沉淀重悬于 350 µL PBS 中。

7. 补偿微珠样本的制备

1. 将单克隆抗体（mAb）用染色缓冲液适当稀释，制备5 µL抗体溶液。
   注意：实验中使用的每种荧光染料标记的单克隆抗体，均需制备相应的补偿微珠样本。
2. 使用前将阴性对照微珠和抗大鼠/仓鼠Ig,κ补偿微珠涡旋混匀。
3. 对于每个样本，加入一滴（约20 μL）阴性对照补偿微珠和一滴抗大鼠/仓鼠Ig,κ补偿微珠。
4. 向管中加入5 µL预稀释的抗体（步骤7.1），并用移液器吹打混匀。
5. 在4 °C避光孵育15分钟。
6. 用2 mL染色缓冲液洗涤样本，在4 °C以400 × g离心5分钟。
7. 弃去上清液，每管加入500 µL PBS重悬沉淀，并涡旋混匀。

8. 流式细胞仪的仪器设置、补偿调节及实验样本采集

注意：有关流式细胞仪的配置，请参见流式细胞仪设置（表 2）。

1. 通用仪器设置与补偿调节
   1. 打开样本采集软件（参见材料表），在工作区功能区中点击新建实验，并选择新建空白实验，以创建一个新的实验。
   2. 双击已创建的实验以打开它。
   3. 在流式细胞仪设置窗口中，点击参数，并选择染色面板中使用的所有通道（例如 PE、APC 等），包括前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）参数。
   4. 通过取消勾选对数刻度，将 Hoechst 参数设置为线性刻度，并为 FSC、SSC 和 Hoechst 勾选电压脉冲的宽度（W）。
      ​注意：默认情况下，所有参数均以对数（log）刻度显示，FSC 和 SSC 除外，它们使用线性刻度。所有参数均通过电压脉冲的面积（A）和高度（H）进行分析。
   5. 在全局工作表中，创建一个散点图，以 FSC-A 为横轴，SSC-A 为纵轴。
   6. 在采集仪表板上点击采集数据，运行未染色的脾脏样本。
   7. 通过在参数部分调整电压值，设置合适的 FSC 和 SSC 参数以观察细胞，并在全局工作表的工作区工具栏中点击多边形门控，在 FSC-A/SSC-A 散点图中创建门控以选择所有显示的细胞。
   8. 将门控后的细胞以直方图形式显示，每个荧光参数作为横轴。
   9. 运行未染色和完全染色的脾脏样本，调节荧光检测器（PMT），使每个荧光参数的染色细胞中阴性与阳性信号之间具有清晰的分离。
   10. 进行补偿设置时，在工作区功能区点击实验，在补偿设置部分选择创建补偿对照。取消勾选包含未染色对照管/孔，然后点击确定。
       ​注意：此操作将生成一个名为补偿对照的样本，以及一个包含多个工作表的普通工作表，每个工作表对应一个选定的参数。
   11. 运行补偿微珠样本（见第6节）；在流式细胞仪窗口中，通过调整电压值并将 FSC 参数的采集阈值设为 5,000，以观察微珠。
   12. 在微珠群体上调整 P1 门控，并确认横轴上正峰和负峰均可见。对每个补偿微珠样本重复此操作，最后在采集仪表板上点击记录数据保存每个样本文件（每个样本至少记录 5,000 个事件）。
   13. 对每个已记录的微珠样本，在正峰和负峰上分别设置 P2 和 P3 门控。
   14. 运行用于补偿的细胞样本（见步骤 4.2 和 4.4.7，以及第5和第6节）。调整 FSC 和 SSC 电压及阈值以观察细胞，调节 P1 门控，最后记录每个样本文件（至少记录 10,000 个事件）。在正峰和负峰上分别设置 P2 和 P3 门控。
       注意：对于 Hoechst 通道的补偿，使用 G₀/G₁ 作为负峰（P3），G₂/M 作为正峰（P2）。
   15. 在工作区功能区点击实验，在补偿设置部分选择计算补偿。
   16. 为创建的补偿设置命名，链接并保存至当前实验。
2. 实验样本采集
   1. 在浏览器工具栏点击新建样本以打开一个样本，并在全局工作表中建立门控策略。
      注意：样本采集的门控策略与样本分析类似，详见图2和第9节。
   2. 在直方图中显示所有事件群体，横轴为 CD3-A。创建一个区间门控，仅选择 CD3⁺ 细胞。
   3. 在采集仪表板中，选择淋巴结样本的存储门控为所有事件，脾脏样本则选择所有事件或 CD3⁺ 细胞。
   4. 以低速运行实验样本，最终记录所有文件，确保从每只免疫小鼠中收集至少 100–200 个抗原特异性 CD8 T 细胞。
      注意：实验样本的文件通常较大（30–120 MB），尤其是当抗原特异性 CD8 T 细胞频率较低时。因此，必须采集大量事件（> 1 × 10⁶）才能记录至少 100–200 个抗原特异性 CD8 T 细胞。大文件可能会减慢后续数据分析过程。仅采集脾脏样本中的 CD3⁺ 细胞（见上述步骤 8.2.2）有助于减小文件大小。
   5. 运行并记录细胞周期分析的阳性对照，即未处理小鼠的骨髓（BM）样本。

9. 数据分析

1. 打开软件（参见材料表），在工作区功能区中点击创建组，为待分析的不同器官创建不同的组（例如，创建组“a-LNs”；“b-脾脏”；“c-BM”）。
   注意：新创建的组将显示在组列表中，而“补偿”组由软件自动生成。
2. 通过双击组名称打开修改组窗口，检查新创建的组是否已同步。若未同步，请在同步功能前插入勾选标记。
3. 将每个.fcs文件拖入其对应的组中。
4. 从“a-LNs”组开始创建设门策略。
5. 双击组中的完全染色样本以打开图形窗口；x轴和y轴的标签与fcs文件中的标注一致（参见流式细胞仪设置，表2）。
6. 在点图中显示该样本获取的全部事件，x轴为DNA-A，y轴为DNA-W。
7. 在图形窗口的设门工具部分点击矩形，仅选择单细胞群体。
   注意：单细胞的DNA-A值如下：2N（低）、介于2N与4N之间（中等）或等于4N（高），而所有单细胞的DNA-W值均相同（图2步骤1）。
8. 双击矩形门的中心，以点图形式显示单细胞，x轴为FSC-A参数，y轴为死细胞染料信号。
9. 在图形窗口的设门工具部分点击多边形，仅选择活细胞群体。活细胞对死细胞染料呈阴性（图2步骤2）。
10. 双击多边形门的中心，以点图形式显示细胞，x轴为FSC-A参数，y轴为SSC-A参数。
11. 点击矩形，创建一个“宽松”门以包含该图中所有单个活细胞（图2步骤3）。
12. 双击“宽松”门的中心，以点图形式显示细胞，x轴为CD3，y轴为CD8。
13. 在图形窗口的设门工具部分点击多边形，选择CD3⁺CD8⁺细胞（图2步骤4）。
14. 双击CD3⁺CD8⁺门的中心，以点图形式显示细胞，x轴为Tetr-gag，y轴为Pent-gag。
15. 在图形窗口的设门工具部分点击多边形，选择抗原特异性CD8 T细胞（Tetr-gag和Pent-gag均呈阳性）（图2步骤5）。
16. 双击gag特异性门的中心，以点图形式显示细胞，x轴为DNA-A，y轴为Ki67（图3）。
17. 在图形窗口的设门工具部分点击四象限，根据不同的细胞周期阶段选择细胞。
    注意：G₀期细胞为Ki67neg-DNA低（左下象限）；G₁期细胞为Ki67pos-DNA低（左上象限）；S-G2/M期细胞为Ki67pos-DNA中/高（右上象限）（图3）。
18. 将在一个样本中创建的设门策略复制到对应组，以将门应用于该组的所有样本。
19. 对“a-LN组”重复步骤9.5至9.18。
20. 检查“b-脾脏”组中每个样本的门是否合适。为分析骨髓细胞中的细胞周期（阳性对照），点击“宽松”门的中心，以点图形式显示细胞，x轴为DNA-A，y轴为Ki67。
21. 检查三个组（即脾脏、淋巴结和骨髓来源细胞）中每个样本的门是否均合适。
    注意：单细胞群体门（步骤9.7）和细胞周期四象限门（步骤9.17）在不同样本中可能具有不同的门坐标，主要由于各样本间Hoechst染料强度可能存在轻微差异（见第6.2节）。因此，可能需要针对每个样本单独调整单细胞群体门和细胞周期四象限门。操作方法如下：双击组名称，取消组属性中的同步设置。此操作允许修改一个样本中的门而不影响该组中其他样本的相同门。取消同步后，根据需要修改相应门。
22. 为可视化本分析所得结果，在工作区功能区点击布局编辑器以打开该功能。将设门策略中的每个门从样本窗格拖至布局编辑器，并按照设门顺序排列图形。如有必要，双击布局中的对应图形，在图形定义窗口中选择适当的类型以更改图形类型。
23. 在布局功能区点击组和按…迭代功能，以可视化各器官的分析结果，并比较不同样本。

表1：流式细胞仪设置。

样本	抗体组合
完全染色	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	CD8 BUV805	Pent-gag PE
Ki67 FMO		CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	CD8 BUV805	Pent-gag PE
Tetr-gag APC FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5		FVD eFluor 780	Hoechst 33342	CD8 BUV805	Pent-gag PE
Pent-gag PE FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	CD8 BUV805
CD8 FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC	FVD eFluor 780	Hoechst 33342		Pent-gag PE
CD3 FMO	Ki67 FITC		Tetr-gag APC	FVD eFluor 780	Hoechst 33342	CD8 BUV805	Pent-gag PE
可固定活力染料 FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC		Hoechst 33342	CD8 BUV805	Pent-gag PE
Hoechst 33342 FMO	Ki67 FITC	CD3 PercpCy5.5	Tetr-gag APC	FVD eFluor 780		CD8 BUV805	Pent-gag PE

表2：流式细胞仪设置。

仪器	BD LSR Fortessa
激光器	蓝色 488 nm		红色 639 nm		紫外 355 nm		黄绿色 561 nm
带通滤光片	530/30	710/50	670/14	780/60	530/30	820/60	585/15	780/60
长通滤光片	505LP	685LP		750LP	505LP	770LP		750LP
使用的荧光染料	FITC	PERCPCY5.5	APC	eFluor 780	Hoechst 33342	BUV805	PE	PECY7
FCS 文件中的对应名称	Alexa Fluor 488	PERCPCY5.5	APC	APC-H7	Hoechst-Red	BUV737	PE	PECY7

结果

图1：骨髓细胞的细胞周期分析。 来自未处理的Balb/c小鼠的骨髓细胞经染色后通过流式细胞术进行分析。（A）设门策略示例。首先在DNA-A/-W图中选择单个细胞（左图），然后通过死细胞染料排除法进一步选择活细胞（中图）。随后，使用“宽松”的FSC-A/SSC-A设门圈选所有骨髓细胞（右图）。（B）骨髓细胞细胞周期分析示例（左图）。我们联合使用Ki67和DNA染色来鉴定细胞周期各时相的细胞：G₀期（左下象限，Ki67阴性-DNA低信号细胞）、G₁期（左上象限，Ki67阳性-DNA低信号细胞）、S-G₂/M期（右上象限，Ki67阳性-DNA中至高信号细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-200 μL 通用型散装包装移液器吸头	Corning	CLS4866-1000EA
2.4G2 抗 FcγR 单克隆抗体	BD	553141	终浓度为 10 μg/ml
5 ml 注射器推杆	BD Emerald	307733
15 ml 圆锥形离心管	MercK Millipore	SBHA025SB
60 mm 经组织培养处理的细胞培养皿	Falcon	353002
70 μm 细胞筛	Falcon	352097
96 孔透明圆底经组织培养处理的细胞培养微孔板	Falcon	353077
抗大鼠/仓鼠 Ig,k/阴性对照补偿微粒	BD- Bioscience	552845
β-巯基乙醇	Sigma	M3148
牛血清白蛋白	Sigma	A07030
BUV805 大鼠抗小鼠 CD8a 抗体	BD- Bioscience	564920	终浓度为 4 μg/ml
不含钙、不含镁的杜氏磷酸盐缓冲液	Euroclone	ECB4004L
Eppendorf 安全锁扣管，1.5 mL	Eppendorf	30120159
乙醇	Sigma	34852-1L-M
乙二胺四乙酸二钠盐溶液（EDTA）	Sigma	E7889
胎牛血清	Corning	35-079-CV
Filcon 无菌注射器式 70 μm 滤器	Falcon	352350
可固定的活率染料 eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	终浓度为 1:1000
Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装	eBioscience	00-5523-00	该套装包含固定/透化浓缩液及稀释液，以及 10 倍浓度的透化缓冲液
H-2k(d) AMQMLKETI 别藻蓝蛋白（APC）标记的四聚体	由 NIH 四聚体核心设施提供		终浓度为 6 μg/ml
H-2k(d) AMQMLKETI 藻红蛋白（PE）标记的五聚体	Proimmune	F176-2A-E - 176	每样本 10 μL
Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物 — 水溶液（10 mg/mL）	ThermoFisher	H3570
Ki-67 单克隆抗体（SolA15），FITC 标记	eBioscience	11-5698-82	终浓度为 5 μg/ml
L-谷氨酰胺 100X（200 mM）	Euroclone	ECB3000D
Millex-HA 过滤器，0.45 µm	BD	340606
青霉素/链霉素 100X	Euroclone	ECB3001D
PE/Cy™7 标记的抗小鼠 CD62L 抗体	Biolegend	104418	终浓度为 0.2 μg/ml
PerCP-Cy™5.5 标记的仓鼠抗小鼠 CD3e 抗体	BD- Bioscience	551163	终浓度为 4.4 μg/ml
红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7757
圆底聚苯乙烯管，5 mL	Falcon	352058
含酚红、不含 L-谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基	Euroclone	ECB9006L
流式细胞术数据分析软件包	FlowJo	v.10
流式细胞仪样本采集软件	BD FACSDiva	v 6.2
台盼蓝溶液	Euroclone	ECM0990D