来源：Torchia, M. L. G.，等。使用双荧光染料流式细胞术区分七种免疫细胞亚群。J. Vis. Exp. (2019)
本视频展示了一种基于流式细胞术的技术，使用两种荧光染料对人类外周血单个核细胞（PBMCs）中的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞、γδ T 细胞、B 细胞、自然杀伤（NK）细胞以及单核细胞进行鉴定。通过将细胞与针对表面标志物的荧光染料标记抗体孵育后，采用优化的流式细胞术设门策略来识别各细胞亚群。
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方法文章
一种用于鉴定外周血单个核细胞中免疫细胞亚群的流式细胞术检测方法
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。
注意：本方案已针对新鲜或冷冻保存的分离外周血细胞及全血进行过测试。
1. 细胞染色
注意：选择光谱重叠极小的荧光染料组合对于减少荧光染料在另一检测通道中的溢出信号至关重要。为了实现对所有细胞亚群的最佳鉴定，应选用量子产率高的荧光染料，例如抗体组合 PE-BV421 和 PE-APC。
- 新鲜和冻存 PBMC 的染色
- 将 100 µL PBMC（1 × 106 个细胞）转移至 96 孔 V 型底板。
注意：使用少于 1 × 106 个细胞也可获得类似结果。 - 在室温下以 350 ×g 离心 3 分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。每孔加入 100 µL 含可固定活/死细胞染料的磷酸盐缓冲液（PBS），该染料可与蛋白质上的游离胺基反应，孵育 10 分钟以标记死细胞。
- 为每个样本配制 30 µL 抗体混合液，包含所有抗体（CD3、CD56、TCRγδ 标记荧光染料 A，C....
- 将 100 µL PBMC（1 × 106 个细胞）转移至 96 孔 V 型底板。
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结果
图1：代表性抗体滴定实验。（A）散点图显示使用指定浓度抗体染色的新鲜外周血单个核细胞（PBMC）上的CD8表达情况。（B）表格列出了各测试浓度下CD8+细胞群的荧光强度中位数及其标准差、CD8-细胞群的中位荧光强度，以及计算得出的染色指数。（C）该图展示了如何根据染色指数确定抗体的最佳使用浓度。（D）CD4抗体的代表性滴定结果。图D经修改自Boin等，2017年
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CD3 | BD Biosciences | 562426 | 用于染色的抗体 RRID: AB_11152082 |
| CD56 | BD Biosciences | 562751 | 用于染色的抗体 RRID: AB_2732054 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331217 | 用于染色的抗体 RRID: AB_2562316 |
| CD4 | BD Biosciences | 555347 | 用于染色的抗体 RRID: AB_395752 |
| CD8 | BD Biosciences | 555367 | 用于染色的抗体 RRID: AB_395770 |
| CD14 | BD Biosciences | 555398 | 用于染色的抗体 RRID: AB_395799 |
| CD19 | BD Biosciences | 555413 | 用于染色的抗体 RRID: AB_395813 |
| CD3 | BD Biosciences | 555335 | 用于染色的抗体 RRID: AB_398591 |
| CD56 | BD Biosciences | 555518 | 用于染色的抗体 RRID: AB_398601 |
| TCRgd | BD Biosciences | 331211 | 用于染色的抗体 RRID: AB_1089215 |
| CCR7 | Biolegend | 353217 | 用于染色的抗体 RRID: AB_10913812 |
| CD45RA | BD Biosciences | 560674 | 用于染色的抗体 RRID: AB_1727497 |
| CCR4 | BD Biosciences | 561034 | 用于染色的抗体 RRID: AB_10563066 |
| CCR6 | BD Biosciences | 353419 | 用于染色的抗体 RRID: AB_11124539 |
| CXCR3 | BD Biosciences | 561730 | 用于染色的抗体 RRID: AB_10894207 |
| CD57 | BD Biosciences | 562488 | 用于染色的抗体 RRID: AB_2737625 |
| HLA-DR | BD Biosciences | 563083 | 用于染色的抗体 RRID: AB_2737994 |
| CD16 | BD Biosciences | 563784 | 用于染色的抗体 RRID: AB_2744293 |
| 死细胞 | Life technologies | L-23105 | 活/死细胞区分 |
| 96孔V型底板 | Thermo fisher | 249570 | 用于染色的板 |
| FACSAria IIu 细胞分选仪 | BD Biosciences | 流式细胞仪 | |
| FCS Express 6 | De Novo Software | FACS分析 | |
| Graphpad Prism | GraphPad software | 数据分析 |
