一种用于鉴定外周血单个核细胞中免疫细胞亚群的流式细胞术检测方法

摘要

来源：Torchia, M. L. G.，等。使用双荧光染料流式细胞术区分七种免疫细胞亚群。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种基于流式细胞术的技术，使用两种荧光染料对人类外周血单个核细胞（PBMCs）中的 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 细胞、γδ T 细胞、B 细胞、自然杀伤（NK）细胞以及单核细胞进行鉴定。通过将细胞与针对表面标志物的荧光染料标记抗体孵育后，采用优化的流式细胞术设门策略来识别各细胞亚群。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

注意：本方案已针对新鲜或冷冻保存的分离外周血细胞及全血进行过测试。

1. 细胞染色

注意：选择光谱重叠极小的荧光染料组合对于减少荧光染料在另一检测通道中的溢出信号至关重要。为了实现对所有细胞亚群的最佳鉴定，应选用量子产率高的荧光染料，例如抗体组合 PE-BV421 和 PE-APC。

1. 新鲜和冻存 PBMC 的染色​
   1. 将 100 µL PBMC（1 × 10⁶ 个细胞）转移至 96 孔 V 型底板。
      注意：使用少于 1 × 10⁶ 个细胞也可获得类似结果。
   2. 在室温下以 350 ×g 离心 3 分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。每孔加入 100 µL 含可固定活/死细胞染料的磷酸盐缓冲液（PBS），该染料可与蛋白质上的游离胺基反应，孵育 10 分钟以标记死细胞。
   3. 为每个样本配制 30 µL 抗体混合液，包含所有抗体（CD3、CD56、TCRγδ 标记荧光染料 A，C....

结果

图1：代表性抗体滴定实验。（A）散点图显示使用指定浓度抗体染色的新鲜外周血单个核细胞（PBMC）上的CD8表达情况。（B）表格列出了各测试浓度下CD8+细胞群的荧光强度中位数及其标准差、CD8-细胞群的中位荧光强度，以及计算得出的染色指数。（C）该图展示了如何根据染色指数确定抗体的最佳使用浓度。（D）CD4抗体的代表性滴定结果。图D经修改自Boin等，2017年

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD3	BD Biosciences	562426	用于染色的抗体 RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	用于染色的抗体 RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	用于染色的抗体 RRID: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	用于染色的抗体 RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	用于染色的抗体 RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	用于染色的抗体 RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	用于染色的抗体 RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	用于染色的抗体 RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	用于染色的抗体 RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	用于染色的抗体 RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	用于染色的抗体 RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	用于染色的抗体 RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	用于染色的抗体 RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	用于染色的抗体 RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	用于染色的抗体 RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	用于染色的抗体 RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	用于染色的抗体 RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	用于染色的抗体 RRID: AB_2744293
死细胞	Life technologies	L-23105	活/死细胞区分
96孔V型底板	Thermo fisher	249570	用于染色的板
FACSAria IIu 细胞分选仪	BD Biosciences		流式细胞仪
FCS Express 6	De Novo Software		FACS分析
Graphpad Prism	GraphPad software		数据分析