一种用于鉴定外周血单个核细胞中免疫细胞亚群的流式细胞术检测方法

摘要

来源：Torchia, M. L. G.，等。使用双荧光染料流式细胞术区分七种免疫细胞亚群。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种基于流式细胞术的技术，使用两种荧光染料对人类外周血单个核细胞（PBMCs）中的 CD4⁺ 和 CD8⁺ T 细胞、γδ T 细胞、B 细胞、自然杀伤（NK）细胞以及单核细胞进行鉴定。通过将细胞与针对表面标志物的荧光染料标记抗体孵育后，采用优化的流式细胞术设门策略来识别各细胞亚群。

方案

所有涉及样本采集的程序均按照本机构的IRB指南进行。

注意：本方案已针对新鲜或冷冻保存的分离外周血细胞及全血进行过测试。

1. 细胞染色

注意：选择光谱重叠极小的荧光染料组合对于减少荧光染料在另一检测通道中的溢出信号至关重要。为了实现对所有细胞亚群的最佳鉴定，应选用量子产率高的荧光染料，例如抗体组合 PE-BV421 和 PE-APC。

1. 新鲜和冻存 PBMC 的染色​
   1. 将 100 µL PBMC（1 × 10⁶ 个细胞）转移至 96 孔 V 型底板。
      注意：使用少于 1 × 10⁶ 个细胞也可获得类似结果。
   2. 在室温下以 350 ×g 离心 3 分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。每孔加入 100 µL 含可固定活/死细胞染料的磷酸盐缓冲液（PBS），该染料可与蛋白质上的游离胺基反应，孵育 10 分钟以标记死细胞。
   3. 为每个样本配制 30 µL 抗体混合液，包含所有抗体（CD3、CD56、TCRγδ 标记荧光染料 A，CD4、CD8、CD19、CD14 标记荧光染料 B）。抗体浓度见表 1和表 2。在此步骤中，也可根据需要加入针对不同靶分子、标记不同荧光染料的已滴定抗体（例如表 3）。
      注意：抗体浓度可能因生产商和批号而异，因此应进行预实验以获得最佳信号。使用 PBS、PBS/0.5% 牛血清白蛋白（BSA）、PBS/0.2% 叠氮化钠或 PBS/0.5% BSA/0.1% 叠氮化钠稀释抗体均可获得类似效果。细胞染色体积也可不同于 30 µL，以便将本方法轻松整合至已有的染色方案中。
   4. 在室温下以 350 ×g 离心 3 分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。向每孔加入抗体混合液，并轻轻重悬细胞，避免产生气泡。在避光条件下室温孵育 30 分钟。
      注意：也可在 4 °C 下染色，结果类似。
   5. 加入 150 µL 染色缓冲液，在室温下以 350 ×g 离心 3 分钟，小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞重悬于 200 µL PBS 中，并在流式细胞仪上获取数据。若改变染色体积，请确保至少将原始抗体混合液稀释 20 倍，以充分洗去未结合的抗体。
      注意：染色后的细胞可用含 2% 多聚甲醛的 PBS 固定，于 4 °C 冰箱中保存过夜，次日再进行流式细胞仪检测。
      警告：多聚甲醛如吞咽有害，可引起皮肤刺激。

2. 抗体滴定

注意：抗体滴定是获得高质量、可重复数据最关键的步骤。抗 CD3、CD8、CD14、CD19 和 TCR γδ 抗体的滴定遵循标准流程，通过最大染色指数确定能够最佳分离阳性与阴性峰的抗体浓度。应选择染色指数曲线上升支中处于峰值或接近峰值的稀释度（图 1A-C）。抗 CD4 抗体的滴定目的是将 CD4 阳性群体的峰值置于 CD3 单阳性群体与 CD3⁺/CD8⁺ T 细胞之间，更靠近 CD3 单阳性信号，以便更好地区分 CD8dim 群体（CD8⁺ γδ T 细胞和 NKT 细胞）。同理，CD56 抗体的滴定旨在将 NK 细胞中的 CD56⁺ 细胞位置定于 CD3⁺ 与 CD3^- 群体之间。

1. 最大染色指数曲线
   注意： 抗CD3、抗CD8、抗CD14、抗CD19和抗TCR γδ的滴定遵循标准操作流程，即通过最大染色指数曲线确定能够最佳区分阳性与阴性峰的抗体浓度。若在检测 panel 中加入针对其他标志物的抗体，亦需采用最大染色指数曲线进行滴定。
   1. 在96孔板中，用40 µL染色缓冲液填充10个孔，以制备2倍抗体稀释液。在第一个孔中，将终体积增加至80 µL染色缓冲液，并加入目的抗体，其浓度为制造商建议浓度的4倍。
   2. 充分混匀后，取40 µL转移至第二孔。充分混匀，并对所有其他孔重复此步骤。
   3. 按照前述方案，使用30 µL 10种不同的抗体2倍系列稀释液分别对10份PBMC或全血样本进行染色。
   4. 使用流式细胞仪获取数据，并绘制各稀释度的信号图（图1A).
   5. 对每种抗体浓度的阴性和阳性细胞群进行设门。抗体浓度的增加可能导致背景信号升高，因此应相应调整阴性门的范围。
   6. 对于每种抗体浓度，提取阴性群体荧光强度的中位数和标准差，以及阳性群体荧光强度的中位数。使用以下公式计算每种抗体浓度的染色指数：（阳性群体荧光强度的中位数 - 阴性群体荧光强度的中位数）÷（2 × 阴性群体荧光强度的标准差）图 1B).
   7. 绘制染色指数与. 以抗体稀释倍数的倒数表示抗体浓度（例如，1:10 稀释 = 0.1），并确定具有最大染色指数值的抗体浓度图1C).
2. 抗CD4和CD56抗体滴定
   注意： 抗CD4和抗CD56抗体的滴定依赖于双荧光染料 panel 中其他标志物的预先滴定。对于抗CD4抗体，滴定的目标是将抗CD4信号定位在双阳性CD8⁺/CD3⁺ 信号以及CD3单阳性细胞群（图1D).
   1. 用2倍稀释法滴定抗CD4和CD56抗体，方法如前所述，并在其中增加若干中间浓度，以精确确定能够区分CD4的浓度范围⁺ T细胞和NK细胞与其他细胞群体。
   2. 将抗CD4抗体进行滴定，使抗CD4信号位于双CD8之间⁺/CD3⁺ 信号以及CD3单阳性细胞群（图1D).
      注意： 应特别注意将 CD4 清晰分离⁺ CD8来源的T细胞⁺ 微弱群体。
   3. 参照抗CD4抗体滴定策略，通过将NK细胞置于CD3阴性与CD3阳性细胞群之间，对抗CD56抗体进行滴定。

3. 门控策略

1. 鉴定淋巴细胞和单核细胞群体，并从分析中去除死细胞及大部分残留的红细胞。
   1. 根据前向散射光选择包含淋巴细胞和单核细胞的整个群体 与 侧向散射面积（FSC-A vs SSC-A）。通过前向散射高度与前向散射宽度（FSC-H vs FSC-W）以及侧向散射高度与侧向散射宽度（SSC-H vs SSC-W）去除细胞聚集体对分析的干扰。
   2. 使用活/死细胞鉴别标记以排除明亮的阳性死细胞和残留的红细胞。根据不同的FSC-A和SSC-A特征圈选淋巴细胞和单核细胞。
2. 淋巴细胞群体的双荧光染料七标记门控策略
   注意： 在 CD3 阳性亚群中，CD4⁺，CD8^+, γδ T细胞可通过仅靶向CD4、CD8和γδ受体的抗体进行分离。类似地，在CD3阴性亚群中，B细胞、NK细胞和单核细胞可分别通过抗CD19、CD56和CD14抗体特异性鉴定。
   1. 选择淋巴细胞门，并创建点图，每个坐标轴分别对应本方案中使用的两种荧光染料之一图2B).
   2. CD8门控⁺ 被鉴定为 CD3 的 T 细胞⁺/CD8⁺ 点图右上角的双阳性细胞（图2B）。排除可能含有NKT细胞的CD8弱表达群体，圈选CD4⁺ 位于CD8之间的T细胞群体鉴定⁺ T细胞和CD3单阳性群体。圈选高表达CD3的γδ T细胞。将γδ T细胞进一步分为CD8阳性和CD8阴性亚群。
   3. 将NK细胞设门定义为位于CD3阳性与CD3阴性细胞之间的细胞群体。将NK细胞进一步划分为CD8阳性与CD8阴性亚群。将B细胞设门定义为CD3阴性CD19阳性细胞。⁺ 点图右下角的细胞群。
   4. 选择单核细胞门，并创建点图，每个轴分别对应本实验方案中使用的两种荧光染料之一图 2C。对CD3设门^-/CD14⁺ 群体

表1： 用于PBMC双荧光染料免疫细胞染色的抗体组合（BV421-PE组合）。

靶标	克隆号	荧光素	供应商	稀释浓度	用途
CD3	UCHT1	BV421	BD	1/20	谱系标记
CD56	NCAM16.2	BV421	BD	1/900
TCRγδ	B1	BV421	Bio	1/30
CD4	RPA-T4	PE	BD	1/450
CD8	RPA-T8	PE	BD	1/20
CD14	M5E2	PE	BD	1/15
CD19	HIB19	PE	BD	1/300
死细胞		L/D Blue	LT	1/300	活/死细胞区分
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

表2：用于PBMC双荧光染料免疫细胞染色的抗体组合（APC-PE组合）。

靶标	克隆号	荧光染料	供应商	稀释浓度	用途
CD3	UCHT1	APC	BD	1/20	谱系标记
CD56	NCAM16.2	APC	BD	1/60
TCRγδ	B1	APC	Bio	1/30
CD4	RPA-T4	PE	BD	1/450
CD8	RPA-T8	PE	BD	1/20
CD14	M5E2	PE	BD	1/15
CD19	HIB19	PE	BD	1/300
死细胞		L/D Blue	LT	1/300	活/死细胞区分
BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies

表3：用于染色多发性骨髓瘤患者冻存外周血单个核细胞的抗体组合。

靶标	克隆	荧光素	货号	供应商	稀释比例	用途
CD3	UCHT1	BV421	562426	BD	1/20	谱系标记
CD56	NCAM16.2	BV421	562751	BD	1/900
TCRγδ	B1	BV421	331217	Bio	1/30
CD4	RPA-T4	PE	555347	BD	1/450
CD8	RPA-T8	PE	555367	BD	1/20
CD14	M5E2	PE	555398	BD	1/15
CD19	HIB19	PE	555413	BD	1/300
CCR7	G043H7	AF647	353217	Bio	1/30	分化
CD45RA	HI100	APC-H7	560674	BD	1/60
CCR4	1G1	PE-Cy7	561034	BD	1/60	Th 亚群
CCR6	G034-E3	BV605	353419	Bio	1/30
CXCR3	1C6/CXCR3	AF488	561730	BD	1/30
CD57	NK-1	PE-CF594	562488	BD	1/900	活化/耗竭
HLA-DR	G46-6	BV510	563083	BD	1/30
CD16	3G8	BUV395	563784	BD	1/30	NK细胞、单核细胞活化
死细胞		L/D Blue	L-23105	LT	1/300	活/死细胞区分

结果

图1：代表性抗体滴定实验。（A）散点图显示使用指定浓度抗体染色的新鲜外周血单个核细胞（PBMC）上的CD8表达情况。（B）表格列出了各测试浓度下CD8+细胞群的荧光强度中位数及其标准差、CD8-细胞群的中位荧光强度，以及计算得出的染色指数。（C）该图展示了如何根据染色指数确定抗体的最佳使用浓度。（D）CD4抗体的代表性滴定结果。图D经修改自Boin等，2017年

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD3	BD Biosciences	562426	用于染色的抗体 RRID: AB_11152082
CD56	BD Biosciences	562751	用于染色的抗体 RRID: AB_2732054
TCRgd	BD Biosciences	331217	用于染色的抗体 RRID: AB_2562316
CD4	BD Biosciences	555347	用于染色的抗体 RRID: AB_395752
CD8	BD Biosciences	555367	用于染色的抗体 RRID: AB_395770
CD14	BD Biosciences	555398	用于染色的抗体 RRID: AB_395799
CD19	BD Biosciences	555413	用于染色的抗体 RRID: AB_395813
CD3	BD Biosciences	555335	用于染色的抗体 RRID: AB_398591
CD56	BD Biosciences	555518	用于染色的抗体 RRID: AB_398601
TCRgd	BD Biosciences	331211	用于染色的抗体 RRID: AB_1089215
CCR7	Biolegend	353217	用于染色的抗体 RRID: AB_10913812
CD45RA	BD Biosciences	560674	用于染色的抗体 RRID: AB_1727497
CCR4	BD Biosciences	561034	用于染色的抗体 RRID: AB_10563066
CCR6	BD Biosciences	353419	用于染色的抗体 RRID: AB_11124539
CXCR3	BD Biosciences	561730	用于染色的抗体 RRID: AB_10894207
CD57	BD Biosciences	562488	用于染色的抗体 RRID: AB_2737625
HLA-DR	BD Biosciences	563083	用于染色的抗体 RRID: AB_2737994
CD16	BD Biosciences	563784	用于染色的抗体 RRID: AB_2744293
死细胞	Life technologies	L-23105	活/死细胞区分
96孔V型底板	Thermo fisher	249570	用于染色的板
FACSAria IIu 细胞分选仪	BD Biosciences		流式细胞仪
FCS Express 6	De Novo Software		FACS分析
Graphpad Prism	GraphPad software		数据分析