一种用于免疫细胞表型与功能特征分析的条形码检测方法

摘要

来源：Baxter, R. M.，等。通过质谱流式细胞术对全外周血进行免疫表型和细胞因子产生的单细胞分析。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种单细胞蛋白质组学方法，该方法采用与重金属偶联的抗体对不同细胞进行独特的条形码标记。随后，通过免疫染色和质谱流式细胞术，评估人全血来源免疫细胞的免疫表型及功能变化。

方案

1. 裂解/固定血液细胞的条形码

1. 将保存在 -80 °C 的裂解/固定细胞样本在冰上缓慢解冻；使用此系统最多可对 20 个样本进行唯一条形码标记并合并。用 PBS 将 10X 条形码通透缓冲液按 1:10 稀释；每样本约需准备 3 mL 缓冲液。
2. 取一个无菌槽加入 CSM，另一个加入 1X 条形码通透缓冲液。向新解冻的样本中加入 1 mL 冰冷的 CSM，用移液器充分混匀，然后转移至相应预标记的聚丙烯簇管中。
3. 取 10 μL 样本，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。将每个簇管中的细胞数量归一化至 1.5–2 × 10⁶ 个细胞：移除并弃去超过 2 × 10⁶ 个细胞的多余体积。
4. 在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。用多通道移液器将细胞重悬于 1 mL 1X 条形码通透缓冲液中，再于室温下以 600 × g 离心 5 分钟。吸除上清液。
5. 将簇管按条形码编码表所示顺序排列在支架上，确保样本与对应条形码匹配。使用多通道移液器向所有簇管样本中加入 800 μL 1X 条形码通透缓冲液，移液枪头不得接触细胞沉淀（不 混匀），以减少细胞损失。将装有簇管的支架暂置一旁。
6. 从 -20 °C 取出 20 重 Pd 条形码试剂盒管条，在室温下解冻。加入 100 μL 1X 条形码通透缓冲液，充分混匀，然后将 120 μL 重悬的条形码混合液加入对应簇管中的细胞样本。
7. 使用多通道移液器充分混匀，确保各条形码标记的样本之间无交叉污染。将簇管在室温下孵育 30 分钟，使条形码完成细胞标记。
8. 在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，然后用 1 mL CSM 重悬细胞。
9. 再次离心并用 CSM 重悬。
   注意： 每个样本现已标记有唯一条形码，样本可进行合并。
10. 在室温下以 600 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。使用单通道移液器并使用同一枪头，将所有样本的细胞沉淀以约 70–80 μL 残余体积转移至一个聚苯乙烯管中。移液枪头不要弹出；将该移液器连同枪头暂置一旁。
11. 使用多通道移液器和新的枪头，向每个原始簇管中加入约 100 μL CSM，以最大限度回收残留细胞。使用前述暂置的单通道移液器（带保留枪头），将所有细胞沉淀以约 100 μL 残余体积转移至同一聚苯乙烯管中。
12. 加入 CSM 至聚苯乙烯管中定容至约 3 mL。计数并记录合并条形码样本的细胞总数。在室温下以 600 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。应在同一天内继续对条形码标记的样本进行染色。
    注意：条形码标记过程中细胞损失约 20–30% 属正常现象。

2. 条形码标记的裂解/固定血液细胞染色及质谱流式细胞仪分析前准备

注意：每1X染色抗体滴度（每100 μL染色反应使用1 μL抗体）通常可染色3–4 × 10⁶个细胞。因此，当所有条形码标记的样本合并至同一管中时，必须相应增加抗体用量。如果20个条形码样本总计为30 × 10⁶个细胞，而每个1X滴度可染色3–4 × 10⁶个细胞，则条形码样本仅需使用10X滴度的抗体，相比之下，若对每个样本单独染色，则需要20X量的抗体（每个单独管使用1X）。每种抗体混合液的抗体浓度与细胞数量之比应进行仔细滴定（本文未讨论）。

1. 使用抗体（材料表）对细胞进行表面染色和细胞因子诱导。
   1. 通过计算所需添加量并考虑移液误差，配制表面染色混合液（例如，若对20个条形码样本进行染色，每个样本含2 × 10⁶个细胞，则需要10倍体积的染色液；在最终体积计算中，为补偿移液误差，应配制10.5倍体积的最终染色溶液）。
   2. 向条形码标记的细胞沉淀中加入相当于10倍体积的表面染色液。为减少细胞损失，使用同一枪头混合并量取表面染色液与细胞沉淀的总体积。
   3. 根据细胞体积和染色混合液体积，加入CSM，使每个细胞样本的最终染色体积为50 μL（例如，若处理一组20个样本，则50 μL × 20 = 1 mL）。在4 °C下孵育30分钟。每15分钟轻轻振荡样本一次，以促进染色均匀。
   4. 在表面染色孵育期间，用过滤的ddH₂O将Perm/Wash缓冲液（材料表）按1:10稀释。准备2 mL用于透化，5 mL用于洗涤。置于4 °C或冰上保存。
   5. 用CSM补满表面染色管，于4 °C以600 × g离心5分钟。吸除上清液。将条形码样本重悬于2 mL、4 °C、1:10稀释的Perm/Wash缓冲液中。在4 °C下孵育20–30分钟，以充分透化细胞。
   6. 于4 °C以600 × g离心5分钟，吸除上清液。
   7. 进行胞内染色时，采用与表面染色类似的步骤。但使用4 °C、1:10稀释的Perm/Wash缓冲液代替CSM来配制总染色体积，以确保细胞在整个胞内染色过程中始终处于透化环境中。
   8. 将胞内抗体混合液加入已完成表面染色并透化的细胞沉淀中（步骤2.1.2–2.1.7）。将总染色体积调整为每个细胞样本50 μL。在4 °C下孵育60分钟。每15分钟振荡样本一次，以确保染色均匀。
   9. 在胞内染色期间，配制嵌入染料溶液：900 μL过滤PBS + 100 μL过滤的16% PFA（终浓度为1.6% PFA）+ 0.2 μL 500 uM嵌入染料（材料表）。
   10. 用冷的1:10稀释Perm/Wash缓冲液补满细胞沉淀与胞内抗体混合液的混合物。
   11. 于4 °C以600 × g离心5分钟，吸除上清液。用CSM补满染色管。计数并记录细胞数量。再次于4 °C以600 × g离心5分钟，吸除上清液。将细胞重悬于1 mL步骤4.9配制的嵌入染料溶液中。在室温下孵育至少20分钟以完成嵌入，或在4 °C过夜（含嵌入染料溶液的样本可在4 °C保存最长1周后再上机进行质谱流式分析）。
2. 准备细胞用于质谱流式仪检测。
   1. 向管中加入3 mL过滤的ddH₂O，于4 °C以600 × g离心5分钟。将细胞重悬于3 mL过滤的ddH₂O中。将该悬液通过100 μm滤膜，以去除可能堵塞质谱流式仪的碎片或聚集体。
   2. 过滤后计数并记录细胞数量。于4 °C以600 × g离心5分钟。
3. 将校准微球溶液（材料表）用过滤的ddH₂O按1:10稀释，配制成工作液。
4. 将染色后的细胞重悬于适量的1:10稀释校准微球溶液中，使细胞浓度达到约1 × 10⁶个细胞/mL。
   注意：CyTOF1仪器在45 µL/min流速下推荐最佳浓度为5 × 10⁵个细胞/mL；Helios仪器在30 µL/min流速下推荐最佳浓度为7.5 × 10⁵个细胞/mL。
5. 将样本上机进行质谱流式分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鲁索利替尼	Santa Cruz	SC-364729A	储存浓度：10 mM；终浓度：5 μM
R848	Invivogen	tlrl-r848-5	储存浓度：1 μg/μL；终浓度：1 μg/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	储存浓度：1 μg/μL；终浓度：0.1 μg/mL
无菌 PBS	Lonza	17-516F
裂解/固定缓冲液	BD biosciences	558049	储存浓度：5X；终浓度：1X（用 ddH₂O 稀释）
BD Phosflow 透膜/洗涤缓冲液 I	BD biosciences	557885	储存浓度：10X；终浓度：1:10（用 ddH₂O 稀释）
RPMI	Gibco	21870-076
叠氮化钠 (NaN₃)	Sigma-Aldrich	S-8032	储存浓度：>99.9%；终浓度：0.0002
蛋白转运抑制剂 (PTI)	eBiosciences	00-4980-93	储存浓度：500X；终浓度：1X
DNA 插入染料	Fluidigm	201192B	储存浓度：500 μM；终浓度：0.1 μM
MaxPar 条形码透膜缓冲液	Fluidigm	201057	储存浓度：10X；终浓度：1X
20-重 Pd 条形码试剂组	Fluidigm	S0014	储存浓度：不适用；终浓度：不适用
质谱流式细胞术所用抗体
表面标志物
CD1c	Biolegend	L161	质量：161
CD3	BD	UCHT1	质量：144
CD4	Biolegend	SK3	质量：174
CD7	BD	M-T701	质量：149
CD8	Biolegend	SK1	质量：142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	质量：209
CD11c	BD	B-ly6	质量：152
CD15	BD	HI98	质量：115
CD14	Biolegend	M5E2	质量：154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	质量：165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	质量：163
CD21	Biolegend	Bu32	质量：141
CD27	BD	L128	质量：155
CD38	Fluidigm	HIT2	质量：172
CD45 总量	Biolegend	HI30	质量：89
CD45RA	Biolegend	HI100	质量：153
CD56	Miltenyi	REA196	质量：168
CD66	BD	B1.1/CD66	质量：113
CD86	Fluidigm	IT2.2	质量：150
CD123	Fluidigm	6H6	质量：143
CD278/ICOS	Biolegend	C398.4A	质量：156
CD179/PD1	Biolegend	EH12.2H7	质量：162
IgD	Biolegend	IA6-2	质量：146
IgM	Biolegend	MHM-88	质量：151
CXCR5	BD	RF8B2	质量：173
HLADR	Biolegend	L243	质量：167
细胞因子
IL-1α	Biolegend	364-3B3-14	质量：147
IL-1β	Biolegend	H1b-98	质量：169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	质量：157
IL-6	Biolegend	MQ2-13A5	质量：164
IL-8	BD	E8N1	质量：160
IL-12/IL-23p40	Biolegend	C8.6	质量：171
IL-17A	Biolegend	BL168	质量：148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	质量：176
MIP1β	BD	D21-1351	质量：158
MCP1	BD	5D3-F7	质量：170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	质量：175
IFNγ	Biolegend	4S.B3	质量：165
PTEN	BD	A2B1	质量：159
TNFα	Biolegend	Mab11	质量：166
注：若制造商标注为 Fluidigm，则该抗体为 Fluidigm 预偶联金属的抗体 ；若制造商非 Fluidigm，则该抗体使用 MaxPar 多金属标记试剂盒（Fluidigm 货号：201300）按照制造商说明书自行偶联。