一种用于免疫细胞表型与功能特征分析的条形码检测方法

摘要

来源：Baxter, R. M.，等。通过质谱流式细胞术对全外周血进行免疫表型和细胞因子产生的单细胞分析。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种单细胞蛋白质组学方法，该方法采用与重金属偶联的抗体对不同细胞进行独特的条形码标记。随后，通过免疫染色和质谱流式细胞术，评估人全血来源免疫细胞的免疫表型及功能变化。

方案

1. 裂解/固定血液细胞的条形码

1. 将保存在 -80 °C 的裂解/固定细胞样本在冰上缓慢解冻；使用此系统最多可对 20 个样本进行唯一条形码标记并合并。用 PBS 将 10X 条形码通透缓冲液按 1:10 稀释；每样本约需准备 3 mL 缓冲液。
2. 取一个无菌槽加入 CSM，另一个加入 1X 条形码通透缓冲液。向新解冻的样本中加入 1 mL 冰冷的 CSM，用移液器充分混匀，然后转移至相应预标记的聚丙烯簇管中。
3. 取 10 μL 样本，使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。将每个簇管中的细胞数量归一化至 1.5–2 × 10⁶ 个细胞：移除并弃去超过 2 × 10⁶ 个细胞的多余体积。
4. 在室温下以 600 × g 离心 5 分钟。用多通道移液器将细胞重悬于 1 mL 1X 条形码通透缓冲液中，再于室温下以 600 × g 离心 5 分钟。吸除上清液。
5. 将簇管按条形码编码表所示顺序排列在支架上，确保样本与对应条形码匹配。使用多通道移液器向所有簇管样本中加入 800 μL 1X 条形码通透缓冲液，移液枪头不得接触细胞沉淀（不 混匀），以减少细胞损失。将装有簇管的支架暂置一旁。
6. 从 -20 °C 取出 20 重 Pd 条形码试剂盒管条，在室温下解冻。加入 100 μL....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
鲁索利替尼	Santa Cruz	SC-364729A	储存浓度：10 mM；终浓度：5 μM
R848	Invivogen	tlrl-r848-5	储存浓度：1 μg/μL；终浓度：1 μg/mL
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	储存浓度：1 μg/μL；终浓度：0.1 μg/mL
无菌 PBS	Lonza	17-516F
裂解/固定缓冲液	BD biosciences	558049	储存浓度：5X；终浓度：1X（用 ddH₂O 稀释）
BD Phosflow 透膜/洗涤缓冲液 I	BD biosciences	557885	储存浓度：10X；终浓度：1:10（用 ddH₂O 稀释）
RPMI	Gibco	21870-076
叠氮化钠 (NaN₃)	Sigma-Aldrich	S-8032	储存浓度：>99.9%；终浓度：0.0002
蛋白转运抑制剂 (PTI)	eBiosciences	00-4980-93	储存浓度：500X；终浓度：1X
DNA 插入染料	Fluidigm	201192B	储存浓度：500 μM；终浓度：0.1 μM
MaxPar 条形码透膜缓冲液	Fluidigm	201057	储存浓度：10X；终浓度：1X
20-重 Pd 条形码试剂组	Fluidigm	S0014	储存浓度：不适用；终浓度：不适用
质谱流式细胞术所用抗体
表面标志物
CD1c	Biolegend	L161	质量：161
CD3	BD	UCHT1	质量：144
CD4	Biolegend	SK3	质量：174
CD7	BD	M-T701	质量：149
CD8	Biolegend	SK1	质量：142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	质量：209
CD11c	BD	B-ly6	质量：152
CD15	BD	HI98	质量：115
CD14	Biolegend	M5E2	质量：154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	质量：165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	质量：163
CD21	Biolegend	Bu32	质量：141
CD27	BD	L128	质量：155
CD38	Fluidigm	HIT2	质量：172
CD45 总量	Biolegend	HI30	质量：89
CD45RA	Biolegend	HI100	质量：153
CD56	Miltenyi	REA196	质量：168
CD66	BD	B1.1/CD66	质量：113
CD86	Fluidigm	IT2.2	质量：150
CD123	Fluidigm	6H6	质量：143
CD278/ICOS	Biolegend	C398.4A	质量：156
CD179/PD1	Biolegend	EH12.2H7	质量：162
IgD	Biolegend	IA6-2	质量：146
IgM	Biolegend	MHM-88	质量：151
CXCR5	BD	RF8B2	质量：173
HLADR	Biolegend	L243	质量：167
细胞因子
IL-1α	Biolegend	364-3B3-14	质量：147
IL-1β	Biolegend	H1b-98	质量：169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	质量：157
IL-6	Biolegend	MQ2-13A5	质量：164
IL-8	BD	E8N1	质量：160
IL-12/IL-23p40	Biolegend	C8.6	质量：171
IL-17A	Biolegend	BL168	质量：148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	质量：176
MIP1β	BD	D21-1351	质量：158
MCP1	BD	5D3-F7	质量：170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	质量：175
IFNγ	Biolegend	4S.B3	质量：165
PTEN	BD	A2B1	质量：159
TNFα	Biolegend	Mab11	质量：166
注：若制造商标注为 Fluidigm，则该抗体为 Fluidigm 预偶联金属的抗体 ；若制造商非 Fluidigm，则该抗体使用 MaxPar 多金属标记试剂盒（Fluidigm 货号：201300）按照制造商说明书自行偶联。