利用基于DNA的张力探针评估免疫细胞施加的受体作用力

摘要

来源：Ma, R. 等，用于绘制免疫细胞瞬时皮牛顿受体力的DNA张力探针。J. Vis. Exp. (2021)

该视频展示了一种利用聚乙二醇锚定的金纳米颗粒和DNA发夹张力探针来评估免疫细胞施加的受体力的方法。CD8阳性T细胞的相互作用会触发探针的展开，从而发出荧光，而锁定链则维持信号，用于量化免疫细胞施加的力。

方案

1. 寡核苷酸制备

1. 将配体链脱氧核糖核酸（DNA）溶解于水（电阻率为18.2 MΩ，整个实验流程均使用此规格水）。涡旋混匀后，使用台式离心机离心收集溶液。调节加水量，使最终浓度为1 mM。使用纳米分光光度计在260 nm处测定吸光度，并根据寡核苷酸的消光系数确定最终浓度。
   注意： 配体链两端均经过修饰，5'端为氨基，3'端为生物素，用于与荧光染料偶联以及呈现生物素化配体。配体链中的氨基需与荧光染料偶联。本实验选用Cy3B染料进行偶联，因其具有高亮度和良好的光稳定性，但该染料通常不直接商业化供应，需自行在实验室完成偶联。因此，下文将描述氨基与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯类染料的偶联方法。对于无法获得核酸修饰相关设备或资源的终端用户，可从提供高亮度、高光稳定性染料（如Alexa和Atto系列染料）的定制DNA合成供应商处直接购买已修饰的核酸。
2. 配制10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）和1 M碳酸氢钠（NaHCO₃）溶液。取10 µL 1 mM氨基配体链溶液（10 nmol），加入10 µL 10x PBS、10 µL 1 M NaHCO₃ 和60 µL H₂O，混匀。在使用前立即用10 µL二甲基亚砜（DMSO）溶解50 µg Cy3B N-羟基琥珀酰亚胺（NHS酯），并将其加入上述混合液中，总体积为100 µL。最后加入Cy3B NHS酯。室温反应1小时，或4 °C过夜反应。
3. 通过将氨基锁定链与Atto647N NHS酯偶联，制备Atto647N标记的锁定链。配制10x PBS和1 M NaHCO₃溶液。取10 µL 1 mM氨基锁定链溶液（10 nmol），加入10 µL 10x PBS、10 µL 1 M NaHCO₃ 和60 µL H₂O，混匀。在使用前立即用10 µL DMSO溶解50 µg Atto647N NHS酯，并将其加入上述混合液中，总体积为100 µL。最后加入Atto647N NHS酯。室温反应1小时，或4 °C过夜反应。
4. 反应完成后，使用P2脱盐凝胶过滤法去除副产物、过量染料及盐分。用H₂O将反应混合物稀释至总体积300 µL，以适配后续高效液相色谱（HPLC）纯化步骤。向离心装置中加入650 µL水合P2凝胶，18,000 x g离心1分钟。弃去装置底部液体，将反应混合物加至含P2凝胶的柱中，18,000 x g离心1分钟，收集装置底部的反应混合物。
   注意： P2凝胶应在使用前至少用H₂O水合4小时。
5. 使用专用于寡核苷酸纯化的C18柱，以反相高效液相色谱（HPLC）对脱盐后的反应混合物进行纯化，流动相A为含0.1 M三乙胺乙酸盐（TEAA）的H₂O，流动相B为乙腈（ACN），采用线性梯度洗脱（50分钟内B相从10%升至100%），流速为0.5 mL/min。将脱盐后的反应混合物通过500 µL进样环注入反相HPLC系统进行纯化。收集在脱氧核糖核酸（DNA）260 nm处有吸收峰、同时在荧光染料处有吸收峰（Cy3B为560 nm，Atto647N为647 nm）的产物，并在真空离心浓缩仪中过夜干燥（见图1A）。
6. 将干燥的寡核苷酸-染料产物重新溶解于100 µL水中。使用纳米分光光度计测定Cy3B配体链和Atto647N锁定链的浓度。确保染料标记比例接近1:1。在测定寡核苷酸浓度时，如需要，应对染料在260 nm处的吸光度进行校正。
7. 使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对纯化产物进行验证，基质为含0.1%三氟乙酸（TFA）和5 mg/mL柠檬酸铵的50% ACN/H₂O溶液，底物为3-羟基丙醛（3-HPA），取1–5 µM浓度的产物溶液0.5 µL用于MALDI-TOF-MS样品制备。示例质谱图见图1B。
8. 将发夹链和淬灭锚定链分别溶解于水中，确保储备液浓度在50至100 µM之间。
   注意： 发夹链未经修饰，可直接由供应商定制合成。锚定链含有巯基锚定基团和淬灭剂BHQ2，也可直接由供应商定制合成。
9. 将所有寡核苷酸分装保存。短期使用和储存时，置于4 °C保存；长期储存时，应冷冻并保存于-20 °C。至此，所有寡核苷酸均已准备好用于DNA张力探针的组装。
   注意： 寡核苷酸可耐受多次冻融循环，不会造成明显影响。

2. 表面准备

注意： DNA发夹张力探针底物的制备需要两天时间。DNA发夹张力探针将被功能化至玻璃盖玻片上。

1. 第1天
   1. 将25 mm盖玻片放置在50 mL烧杯中的聚四氟乙烯架上。每个架子最多可容纳8个盖玻片。通过将盖玻片浸入水中三次，对其进行冲洗。
   2. 向装有架子和盖玻片的烧杯中加入40 mL体积比为1:1（v:v）的乙醇-水混合溶液，并用封口膜密封烧杯。
   3. 将烧杯置于超声波清洗机中（工作频率35 KHz），超声处理15分钟以清洁盖玻片。超声结束后，倒掉液体，并用自来水对带架子的盖玻片至少冲洗6次，以去除残留的有机溶剂。
   4. 通过将浓硫酸与过氧化氢按3:1的体积比混合，配制新鲜的piranha溶液。配制40 mL piranha溶液时，先向一个洁净的50 mL烧杯中加入30 mL浓硫酸，然后缓慢加入10 mL过氧化氢（H₂O₂）。加入H₂O₂后，piranha溶液会迅速发热并产生气泡。使用玻璃移液管末端轻轻搅匀piranha溶液。
   5. 接下来，将承载盖玻片的架子转移至装有轻柔混合的piranha溶液的烧杯中进行蚀刻处理（图2A）。在室温下让piranha溶液对盖玻片进行羟基化和清洁处理30分钟。蚀刻完成后，使用不锈钢或聚四氟乙烯镊子将架子转移至盛有去离子水的洁净50 mL烧杯中，并再次用去离子水至少冲洗6次。
      注意：大量有机物可能与piranha溶液剧烈反应，甚至引发爆炸。操作时务必小心，始终在通风橱内进行。必须穿戴实验服、手套和护目镜。切勿将新配制的piranha溶液储存在密闭容器中。
      备注：过氧化氢与硫酸的体积比应保持在1:2以下（v:v），绝不可超过1:1。将装有盖玻片的架子浸入piranha溶液时，应缓慢且小心地放入。蚀刻后切勿立即丢弃溶液，因其仍具有活性且温度较高。应将溶液在烧杯中静置过夜，再倒入酸性废液容器中。
   6. 将承载盖玻片的架子浸入含40 mL乙醇的50 mL烧杯中以去除水分。倒掉乙醇并重复此步骤3次，确保彻底去除水分。
   7. 随后将架子浸入40 mL含3%（v/v）3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）的乙醇溶液中，在室温下反应1小时，使APTES与盖玻片表面的-OH基团发生反应（图2B）。
      备注：乙醇可用丙酮替代。
   8. 用40 mL乙醇将表面浸没冲洗6次，然后在80 °C烘箱中干燥20分钟。冷却后，将干燥的氨基修饰盖玻片储存于-20 °C，以备后续使用（最长可保存6个月）。
   9. 用封口膜覆盖直径为10 cm的塑料培养皿底部内侧。封口膜可防止盖玻片在培养皿内滑动，并有助于在后续功能化步骤中将溶液保留在盖玻片表面。将冷却后的氨基修饰盖玻片放入培养皿中，需功能化的面朝上。
   10. 为修饰盖玻片上的氨基基团，向每张盖玻片上加入300 µL含0.5% w/v硫辛酸聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯（LA-PEG-SC）和2.5% w/v甲氧基聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺酯（mPEG-SC）的0.1 M NaHCO₃溶液，在室温下孵育1小时（图2C）。对于每张25 mm盖玻片，称取1.5 mg LA-PEG-SC和7.5 mg mPEG-SC。由于NHS试剂在室温水溶液中的半衰期较短（约10分钟），应在使用前立即溶解并加入表面。反应结束后，用去离子水冲洗表面3次。
       备注：NHS反应也可在4 °C下过夜进行。在4 °C时，NHS试剂水解前的半衰期约为4–6小时，此方案将使表面制备过程延长至三天。
   11. 向一组“三明治”结构的盖玻片（两张盖玻片相对放置，中间夹有反应缓冲液）中加入100 µL含1 mg/mL磺基-NHS乙酸酯的0.1 M碳酸氢钠（NaHCO₃）溶液。让钝化反应至少进行30分钟。为节约试剂，也可使用50 µL含1 mg/mL磺基-NHS乙酸酯的溶液。钝化完成后，用去离子水冲洗3次。
   12. 向每张盖玻片加入0.5 mL金纳米颗粒（AuNP，8.8 nm，单宁酸稳定，0.05 mg/mL），在室温下孵育30分钟（图2D）。为节约试剂，此步骤也可通过将两张盖玻片制成“三明治”结构进行。确保前步操作中无盐类残留，以避免金纳米颗粒聚集。此步骤后切勿让盖玻片干燥。
   13. 同时，在聚合酶链式反应（PCR）管中，将4.7 pN发夹结构、Cy3B配体链和BHQ2锚定链按1.1:1:1的比例混合于1 M氯化钠（NaCl）溶液中，终浓度为300 nM。在热循环仪中将混合液加热至95 °C保持5分钟，然后在30分钟内逐步降温至20 °C，完成退火过程。
   14. 与金纳米颗粒孵育30分钟后，用去离子水冲洗盖玻片3次。向已退火的DNA溶液中加入额外的BHQ2锚定链（来自100 µM母液），使BHQ2锚定链与Cy3B配体链的比例达到10:1。此时，DNA溶液中应含有300 nM的张力探针结构和2.7 µM的BHQ2单链。每两张盖玻片之间加入100 µL溶液，形成“三明治”结构（图2E）。
   15. 小心地将湿润的实验纸球置于培养皿中（远离盖玻片），并用封口膜密封培养皿，防止溶液蒸发。用铝箔包裹培养皿，在4 °C下过夜孵育。
2. 第2天
   1. 用1× PBS冲洗盖玻片，去除未结合的探针。在落射荧光显微镜下检查DNA张力探针表面的质量。
   2. 在1× PBS中配制40 µg/mL链霉亲和素溶液，加入盖玻片后在室温下孵育30分钟（图2F）。通常每张25 mm盖玻片使用100 µL即可。孵育结束后用PBS冲洗3次，去除未结合的链霉亲和素。
   3. 在1× PBS中配制40 µg/mL生物素化抗体/配体溶液。每“三明治”结构加入50–100 µL，在室温下孵育30分钟（图2G）。孵育结束后用PBS冲洗3次，去除未结合的生物素化抗体/配体。
   4. 小心组装洁净的成像腔室，注意避免在拧紧时压裂表面。向成像腔室中加入0.5–1 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS），并准备好用于后续细胞成像实验（图2H）。

3. 成像细胞受体受力

1. 将目标免疫细胞在 HBSS 中配制为 1-2 × 10⁶ 个细胞/mL。
   注意：本文以 OT-1 CD8+ 初始T细胞为例。根据制造商说明书，使用 MACS 小鼠 CD8⁺ T 细胞分离试剂盒和磁性激活细胞分选（MACS）分选仪，从小鼠脾脏中纯化 OT-1 CD8⁺ 初始T细胞。通过去除与磁性耗竭抗体混合物结合的非CD8+ T细胞，分离并富集 CD8⁺ T 细胞。将纯化的 OT-1 CD8+ 初始T细胞重悬于 HBSS 中，浓度为 2 × 10⁶ 个细胞/mL，并置于冰上保存待用。
2. 在添加配体或接种细胞前，使用荧光显微镜（100倍物镜）检查DNA发夹张力探针表面质量以进行质量控制。在DNA发夹张力探针表面的不同位置（至少5个位置）及3个重复样本中，对Cy3B通道的平均背景强度进行成像和定量。保持成像采集条件一致，以便该数值可作为表面质量和探针密度的可靠指标（图3C）。
   注意：在最初几次制备表面时，应根据文献方法定量每金纳米颗粒上的DNA链数以及每µm²面积上的金纳米颗粒数量，该数据可作为评估表面质量的另一可靠指标。
3. 将约 4 × 10⁴ 至 10 × 10⁴ 个细胞接种到每个功能化DNA张力探针盖玻片上，在室温下孵育约15分钟，使细胞贴附并铺展。
4. 当细胞接种至DNA发夹张力探针表面并开始铺展时，使用100倍物镜对Cy3B通道中产生的荧光信号进行成像（图2I）。
5. 当细胞在DNA发夹张力探针表面的Cy3B通道中开始产生实时张力信号后，同时在Cy3B和Atto647N通道中采集图像（全内反射荧光显微镜（TIRF）比落射荧光显微镜具有更高的信噪比）。随后，在成像腔室中加入Atto647N链，终浓度为200 nM，用于机械选择性杂交。
6. 孵育10分钟后，迅速而轻柔地移除含有荧光Atto647N锁定链的缓冲液，并替换为新鲜的Hank's平衡盐溶液。再次在Cy3B和Atto647N通道中成像，并使用Fiji软件计算Pearson相关系数。
7. 在研究所需的时间点，向成像腔室中的细胞引入非荧光锁定链，以储存张力信号。配制锁定链储备液（100 µM），加入细胞中使其终浓度为1 µM。轻柔吹打混匀。锁定持续时间可变化，但推荐时间为10分钟。
8. 根据需要，使用落射荧光显微镜采集时间序列图像或终点图像，用于定性张力图谱绘制和定量分析（图2J 和 图4）。
   注意：若需在多个时间点进行张力测量，可通过加入解锁链启动储存张力信号的清除。为避免过度冲洗，使用较高终浓度（2 µM）的解锁链孵育3分钟，启动与锁定链的toehold介导的链置换反应，从而清除储存的信号（图2J）。用HBSS轻柔冲洗去除多余的寡核苷酸。DNA发夹张力探针表面和细胞即可进入下一轮张力储存与图谱绘制。若研究仅关注单一时间点，则无需解锁张力信号。

结果

图 1：寡核苷酸制备示例。 （A）Cy3B 配体链纯化的 HPLC 色谱图；（B）产物的 MALDI-TOF-MS 谱图；（C）起始物料与标记寡核苷酸的计算质量及实测 m/z 峰值对照表。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-羟基吡啶酸（3-HPA）	Sigma	56197	Maldi-TOF-MS 基质
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	表面处理
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Acros	AC430941000	表面处理
10倍红细胞裂解缓冲液	Biolegend	00-4333-57	缓冲液
8.8 nm 金纳米颗粒，单宁酸	Nanocomposix	定制订单	表面处理
Atto647N NHS 酯	Sigma	18373-1MG-F	荧光染料，寡核苷酸制备
用于显微镜的 Attofluor 细胞培养皿	Thermo Fisher Scientific	A7816	成像
BD 注射器（仅限带鲁尔锁）	BD bioscience	309657	细胞
生物素标记抗小鼠 CD3e 抗体	ebioscience	13-0031-82	抗体/配体
生物素标记 pMHC 卵清蛋白（SIINFEKL）	埃默里大学 NIH 四聚体核心设施	NA	抗体/配体
牛血清白蛋白	Sigma	735078001	封闭非特异性相互作用
细胞筛	Biologix	15-1100	细胞
盖玻片迷你支架，聚四氟乙烯材质	Thermo Fisher Scientific	C14784	表面处理
Cy3B NHS 酯	GE Healthcare	PA63101	荧光染料，寡核苷酸制备
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Corning	21-031-CM	缓冲液
乙醇	Sigma	459836	表面处理
汉克平衡盐溶液（HBSS）	Sigma	H8264	缓冲液
过氧化氢	Sigma	H1009	表面处理
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3.4K	表面处理
Midi MACS（LS）启动试剂盒	Miltenyi Biotec	130-042-301	细胞
小鼠 CD8+ T 细胞分离试剂盒	Miltenyi Biotec	130-104-075	细胞
Nanosep MF 离心装置	Pall laboratory	ODM02C35	寡核苷酸制备
2号圆形玻璃盖玻片	VWR	48382-085	表面处理
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	N475-10	表面处理
P2 凝胶	Bio-rad	1504118	寡核苷酸制备
硫酸	EMD Millipore Corporation	SX1244-6	表面处理
磺基-NHS 乙酸酯	Thermo Fisher Scientific	26777	表面处理
设备
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 色谱柱，4.6 × 150 mm，2.7 μm	653950-702		寡核苷酸制备
Barnstead Nanopure 水纯化系统	Thermo Fisher		水
CFI Apo 100× NA 1.49 物镜	Nikon		显微镜
Cy5 滤光片组	CHROMA		显微镜
Evolve 电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）	Photometrics		显微镜
高效液相色谱仪	Agilent 1100		寡核苷酸制备
Intensilight 正置荧光光源	Nikon		显微镜
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）	Voyager STR		寡核苷酸制备
Nanodrop 2000 紫外-可见分光光度计	Thermo Fisher		寡核苷酸制备
Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜	Nikon		显微镜
Nikon 完美聚焦系统	Nikon		显微镜
NIS Elements 软件	Nikon		显微镜
四通道 TIRF 405/488/561/647 滤光片组	CHROMA		显微镜
RICM 滤光片组	CHROMA		显微镜
TIRF 激光耦合器，配备 488 nm（50 mW）、561 nm（50 mW）和 640 nm 激光器	Coherent		显微镜
TRITC 滤光片组	CHROMA		显微镜
寡核苷酸名称	5' 修饰 / 3' 修饰	序列（5' 到 3'）	用途
15mer 胺锁定链	5' 修饰：无修饰 3' 修饰：/3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	锁定实时张力信号
15mer Atto647N 锁定链	5' 修饰：Atto647N 3' 修饰：/3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	锁定实时张力信号
15mer 非荧光锁定链	5' 修饰：无修饰 3' 修饰：无修饰	A AAA AAC ATT TAT AC	用于定量分析的锁定实时张力信号
4.7 pN 发夹链	5' 修饰：无修饰 3' 修饰：无修饰	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	发夹探针
胺配体链	5' 修饰：/5AmMC6/ 3' 修饰：/3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	发夹探针
BHQ2 锚定链	5' 修饰：/5ThiolMC6-D/ 3' 修饰：/3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	发夹探针
Cy3B 配体链	5' 修饰：Cy3B 3' 修饰：/3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	发夹探针
解锁链	5' 修饰：无修饰 3' 修饰：无修饰	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	解锁累积的张力信号