来源：Ma, R. 等，用于绘制免疫细胞瞬时皮牛顿受体力的DNA张力探针。J. Vis. Exp. (2021)
该视频展示了一种利用聚乙二醇锚定的金纳米颗粒和DNA发夹张力探针来评估免疫细胞施加的受体力的方法。CD8阳性T细胞的相互作用会触发探针的展开，从而发出荧光，而锁定链则维持信号，用于量化免疫细胞施加的力。
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方法文章
利用基于DNA的张力探针评估免疫细胞施加的受体作用力
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
1. 寡核苷酸制备
- 将配体链脱氧核糖核酸（DNA）溶解于水（电阻率为18.2 MΩ，整个实验流程均使用此规格水）。涡旋混匀后，使用台式离心机离心收集溶液。调节加水量，使最终浓度为1 mM。使用纳米分光光度计在260 nm处测定吸光度，并根据寡核苷酸的消光系数确定最终浓度。
注意： 配体链两端均经过修饰，5'端为氨基，3'端为生物素，用于与荧光染料偶联以及呈现生物素化配体。配体链中的氨基需与荧光染料偶联。本实验选用Cy3B染料进行偶联，因其具有高亮度和良好的光稳定性，但该染料通常不直接商业化供应，需自行在实验室完成偶联。因此，下文将描述氨基与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯类染料的偶联方法。对于无法获得核酸修饰相关设备或资源的终端用户，可从提供高亮度、高光稳定性染料（如Alexa和Atto系列染料）的定制DNA合成供应商处直接购买已修饰的核酸。 - 配制10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）和1 M碳酸氢钠（NaHCO3）溶液。取10 µL 1 mM氨基配体链溶液（10 nmol），加入10 µL 10x PBS、10 µL 1 M NaHCO3 和60 µL H2O，混匀。在使用前立即用10 µL二甲基亚砜（DMSO）溶解50 µg Cy3B N-羟基琥珀酰亚胺（NHS酯），并将其加入上述混合液中，总体积为100 µL。最后加入Cy3B NHS酯。室温反....
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结果
图 1：寡核苷酸制备示例。 （A）Cy3B 配体链纯化的 HPLC 色谱图；（B）产物的 MALDI-TOF-MS 谱图；（C）起始物料与标记寡核苷酸的计算质量及实测 m/z 峰值对照表。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-羟基吡啶酸（3-HPA） | Sigma | 56197 | Maldi-TOF-MS 基质 |
| mPEG-SC | Biochempeg | MF001023-2K | 表面处理 |
| (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 | Acros | AC430941000 | 表面处理 |
| 10倍红细胞裂解缓冲液 | Biolegend | 00-4333-57 | 缓冲液 |
| 8.8 nm 金纳米颗粒，单宁酸 | Nanocomposix | 定制订单 | 表面处理 |
| Atto647N NHS 酯 | Sigma | 18373-1MG-F | 荧光染料，寡核苷酸制备 |
| 用于显微镜的 Attofluor 细胞培养皿 | Thermo Fisher Scientific | A7816 | 成像 |
| BD 注射器（仅限带鲁尔锁） | BD bioscience | 309657 | 细胞 |
| 生物素标记抗小鼠 CD3e 抗体 | ebioscience | 13-0031-82 | 抗体/配体 |
| 生物素标记 pMHC 卵清蛋白（SIINFEKL） | 埃默里大学 NIH 四聚体核心设施 | NA | 抗体/配体 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | 735078001 | 封闭非特异性相互作用 |
| 细胞筛 | Biologix | 15-1100 | 细胞 |
| 盖玻片迷你支架，聚四氟乙烯材质 | Thermo Fisher Scientific | C14784 | 表面处理 |
| Cy3B NHS 酯 | GE Healthcare | PA63101 | 荧光染料，寡核苷酸制备 |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Corning | 21-031-CM | 缓冲液 |
| 乙醇 | Sigma | 459836 | 表面处理 |
| 汉克平衡盐溶液（HBSS） | Sigma | H8264 | 缓冲液 |
| 过氧化氢 | Sigma | H1009 | 表面处理 |
| LA-PEG-SC | Biochempeg | HE039023-3.4K | 表面处理 |
| Midi MACS（LS）启动试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | 细胞 |
| 小鼠 CD8+ T 细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-104-075 | 细胞 |
| Nanosep MF 离心装置 | Pall laboratory | ODM02C35 | 寡核苷酸制备 |
| 2号圆形玻璃盖玻片 | VWR | 48382-085 | 表面处理 |
| NTA-SAM | Dojindo Molecular Technologies | N475-10 | 表面处理 |
| P2 凝胶 | Bio-rad | 1504118 | 寡核苷酸制备 |
| 硫酸 | EMD Millipore Corporation | SX1244-6 | 表面处理 |
| 磺基-NHS 乙酸酯 | Thermo Fisher Scientific | 26777 | 表面处理 |
| 设备 | |||
| Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 色谱柱，4.6 × 150 mm，2.7 μm | 653950-702 | 寡核苷酸制备 | |
| Barnstead Nanopure 水纯化系统 | Thermo Fisher | 水 | |
| CFI Apo 100× NA 1.49 物镜 | Nikon | 显微镜 | |
| Cy5 滤光片组 | CHROMA | 显微镜 | |
| Evolve 电子倍增电荷耦合器件（EMCCD） | Photometrics | 显微镜 | |
| 高效液相色谱仪 | Agilent 1100 | 寡核苷酸制备 | |
| Intensilight 正置荧光光源 | Nikon | 显微镜 | |
| 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS） | Voyager STR | 寡核苷酸制备 | |
| Nanodrop 2000 紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher | 寡核苷酸制备 | |
| Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜 | Nikon | 显微镜 | |
| Nikon 完美聚焦系统 | Nikon | 显微镜 | |
| NIS Elements 软件 | Nikon | 显微镜 | |
| 四通道 TIRF 405/488/561/647 滤光片组 | CHROMA | 显微镜 | |
| RICM 滤光片组 | CHROMA | 显微镜 | |
| TIRF 激光耦合器，配备 488 nm（50 mW）、561 nm（50 mW）和 640 nm 激光器 | Coherent | 显微镜 | |
| TRITC 滤光片组 | CHROMA | 显微镜 | |
| 寡核苷酸名称 | 5' 修饰 / 3' 修饰 | 序列（5' 到 3'） | 用途 |
| 15mer 胺锁定链 | 5' 修饰：无修饰 3' 修饰：/3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | 锁定实时张力信号 |
| 15mer Atto647N 锁定链 | 5' 修饰：Atto647N 3' 修饰：/3AmMO/ | AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA | 锁定实时张力信号 |
| 15mer 非荧光锁定链 | 5' 修饰：无修饰 3' 修饰：无修饰 | A AAA AAC ATT TAT AC | 用于定量分析的锁定实时张力信号 |
| 4.7 pN 发夹链 | 5' 修饰：无修饰 3' 修饰：无修饰 | GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC | 发夹探针 |
| 胺配体链 | 5' 修饰：/5AmMC6/ 3' 修饰：/3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | 发夹探针 |
| BHQ2 锚定链 | 5' 修饰：/5ThiolMC6-D/ 3' 修饰：/3BHQ_2/ | TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT | 发夹探针 |
| Cy3B 配体链 | 5' 修饰：Cy3B 3' 修饰：/3Bio/ | CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT | 发夹探针 |
| 解锁链 | 5' 修饰：无修饰 3' 修饰：无修饰 | TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C | 解锁累积的张力信号 |
