一种基于CFSE的检测方法用于监测感染小鼠皮肤树突状细胞向引流淋巴结的迁移

摘要

来源：Bollampalli, V. P.，等。一种基于CFSE的检测方法，用于研究小鼠皮肤树突状细胞在牛分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin）感染期间向引流淋巴结的迁移。 J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了一种用于监测小鼠足垫感染牛分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG）后树突状细胞迁移的实验方法。细菌感染后，活化的皮肤树突状细胞被一种细胞通透性的羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）染料标记。在树突状细胞迁移至腘窝引流淋巴结的适当时间间隔后，分离淋巴结细胞，并对其进行树突状细胞特异性表面标志物的免疫染色。通过流式细胞术鉴定已迁移的树突状细胞。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. CFSE 储存液的配制与保存

1. 用二甲基亚砜配制5 mM的5-和6-羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）储备液。涡旋混匀。将100 µl分装至无菌的0.5 ml螺口微量离心管中。于-80 °C保存分装液。

2. 小鼠

1. 使用8至12周龄的近交系雄性或雌性小鼠。建议使用性别和年龄相匹配的动物。在开始实验前，确保已获得必要的动物伦理许可。

3. 使用异氟烷气体麻醉固定动物

1. 向麻醉机中加入异氟烷。用异氟烷填充10 ml气密玻璃注射器，避免引入气泡。使用提供的管路将注射器与液体入口连接，并推动推杆，直至连接管中的液体明显即将进入蒸发器。
   注意：不使用时，请勿将异氟烷储存在注射器中。
2. 在诱导室中使用异氟烷对动物进行麻醉，维持气流速度约为400 - 500 ml/min，异氟烷浓度为3.5%。
   注意：若无气流，设备将无法运行。
3. 当动物进入睡眠状态后，转动麻醉机上的旋塞阀，使异氟烷气体通向面罩部分。检查面罩是否完好，以防止气体泄漏。气流可维持在400 ml/min，也可选择性降低至200 ml/min。将异氟烷浓度降至2.6%。
   注意：可通过调节气流速度来增强或减弱麻醉效果。

4. BCG 注射与回收

1. 在注射前，通过肉眼观察并进行足趾捏压反射测试等方法，确认小鼠在异氟烷面罩上已处于固定/睡眠状态。
2. 使用配备29 G × ½英寸针头的注射器，在小鼠后足垫接种30 µl磷酸盐缓冲液（PBS）中含有1 × 10⁶菌落形成单位的Mycobacterium bovis卡介苗（BCG）。
   注意： 分枝杆菌菌液的制备方法在本实验方案的原始描述中有简要说明，其他文献中也有详细描述。BCG也可直接从商业来源获得。作者建议在接种小鼠前，对BCG进行脉冲式超声处理或反复通过注射器以打散菌体聚集体。尽管BCG在此处被再次提及作为微生物刺激物，因其在本方案原始描述中已被使用3，但作者也明确鼓励尝试其他微生物刺激物。
3. 对对照组小鼠采用上述相同操作，注射PBS。
4. 注射后监测动物，确认其麻醉后恢复良好，并能正常承重于注射过的后足垫。

5. CFSE 注射

1. CFSE 注射液的制备
   1. 从 -80 °C 取出一管 5 mM CFSE 储存液，解冻后用 PBS 稀释 10 倍。在将溶液吸入注射器前，充分重悬混匀。
2. CFSE 注射与回收
   1. 重复第 3 节中动物麻醉的操作步骤。在先前接种过 BCG 或 PBS 的后足垫皮下注射 20 µl 0.5 mM CFSE。
      注意：CFSE 注射应在计划处死动物的前一天（24 小时前）进行。

6. 腘窝淋巴结（pLN）的手术切除

注意：建议在整个步骤中使用已灭菌的手术器械，并反复用70%乙醇进行去污处理。

1. 处死小鼠。用70%乙醇喷洒动物尸体。将动物仰卧位固定在解剖板上。
   注意：作者推荐通过颈椎脱位法处死动物。
2. 在后侧大腿处小心做一纵向切口。使用剪刀和镊子清除肌肉和脂肪组织，暴露位于膝窝脂肪囊深处的腘淋巴结（pLN），并将其切除。
3. 将腘淋巴结（pLN）转移至0.5 ml无菌PBS中，置于冰上。

7. 从 pLN 制备单细胞悬液

1. 将pLN通过置于6孔板中的70微米细胞筛进行匀浆，6孔板内含5 ml PBS或流式细胞分选（FACS）缓冲液（含2%胎牛血清（FCS）、5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和1 mM叠氮化钠的PBS）。使用3 ml注射器的尾端通过细胞筛进行匀浆。
   注意： 叠氮化钠具有毒性，操作时应谨慎。
2. 用另外5 ml PBS或FACS缓冲液冲洗滤网，将冲洗液收集至15 ml离心管中，在4 °C、277 × g（1,200 rpm，R = 172 mm）条件下离心5分钟，沉淀细胞。或者，可直接在微量离心管中使用聚丙烯匀浆器对pLNs进行匀浆处理。
3. 根据沉淀物的大小，将pLN悬液重悬于适当体积的PBS或FACS缓冲液中， 例如，200 - 1,000 µl。使用计数板对每份淋巴结悬液获得的总细胞数进行定量。使用台盼蓝排除死细胞或濒死细胞。

8. 细胞染色与流式细胞术

1. 将 1 - 10 × 10⁶ 个细胞转移至 5 ml 圆底聚苯乙烯管中。用 FACS 缓冲液洗涤，并在 4 °C 条件下，以 277 × g（1,200 rpm，R = 172 mm）离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
2. 弃去上清液，将沉淀重悬于 50 - 100 µl 抗体混合液中（见树突状细胞 [DC] 表面染色所用标记物，《材料表》），其中包含 0.5 - 1 µg 抗小鼠 CD16/CD32 抗体（用于阻断非特异性 Fc 介导的相互作用），置于冰上孵育 30 - 45 分钟。避免样品暴露于光照下。
3. 孵育结束后，用 FACS 缓冲液洗涤细胞，并在 4 °C 条件下，以 277 × g（1,200 rpm，R = 172 mm）离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
4. 将细胞重悬于 50 - 100 µl FACS 缓冲液中，使用流式细胞仪采集数据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷	Baxter	1001936060
5-和6-羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）	Invitrogen	C1157
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2650
胎牛血清（FBS）	Sigma	F7524
卡介苗（Bacille Calmette-Guérin，BCG）			菌株 Pasteur，实验室自备
台盼蓝溶液	Sigma	T8154
EDTA			内部
叠氮化钠	Sigma	S2002
PBS			内部
过滤水			内部
BD Plastipak 3 ml 注射器	BD 医疗外科系统	309658	替代方案：5 ml 注射器
6孔板	TPP	92006
15 ml 离心管	TPP	91015	聚丙烯
5 ml 圆底管	BD Falcon	3272948	聚苯乙烯
Univentor 400 麻醉机	Univentor	8323001
Monojet 3/10 ml 注射器	Medicarrier	8881511144	29 G × 1/2 英寸
无菌滤器单元	TPP	99500	PES 膜
EPPI-花柱匀浆器	Schuett生物技术	3.200 512	聚丙烯
Allegra X-30R 离心机	贝克曼库尔特	B01145
布氏计数室	VWR	631-0920
0.5 ml 螺口盖微量离心管	Sarstedt	72.73	聚丙烯
1.5 ml Eppendorf 微量离心管	VWR	700-5239	聚丙烯
70 微米细胞筛	VWR	734-0003
FlowJo 细胞分析软件	Tree Star
抗体	克隆	公司
抗体
MHC-II I-A/I-E	M5/114.15.2	BD 生物科学
CD11b	M1/70	BD 生物科学
CD11c	HL3	BD 生物科学
CD16/CD32（Fc阻断剂）	2.4G2	BD 生物科学
CD326/EpCAM	G8.8	Biolegend
CD103	2.00×10⁷	Biolegend
CD80	16-10A1	Biolegend
CD86	GL-1	Biolegend