原代人类免疫细胞抗真菌活性的实时评估

摘要

来源：Brunel, S. F. 等，人原代中性粒细胞和单核细胞对A. fumigatus的抗真菌活性实时成像。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用荧光标记的Aspergillus报告分生孢子对人中性粒细胞抗真菌活性进行活细胞成像的分析方法。最初，中性粒细胞内可同时检测到红色和洋红色荧光，随着时间推移，红色荧光逐渐减弱，表明分生孢子被降解，从而证实了中性粒细胞具有抗真菌活性。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. A. fumigatus 培养与培养条件

1. 按所述方法制备葡萄糖最低限度琼脂培养基。
   1. 使用 1 M 氢氧化钠 (NaOH) 将培养基 pH 调至 6.5，并在 120 °C 下高压灭菌 20 分钟。
   2. 冷却至 65 °C。
   3. 在无菌操作台中，将 30 mL 冷却后的培养基倒入 T75 培养瓶中，并将瓶口置于 25 mL 移液管上，使培养基倾斜凝固形成斜面。
2. 将 dsRed Af293-Aspergillus fumigatus 菌株在琼脂斜面上划线接种，并于 37 °C、5% 二氧化碳 (CO₂) 条件下培养 7 天。两个培养瓶可获得约 10⁹  个分生孢子，悬浮于 5 mL 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中，用于生物素标记前处理。

2. A. fumigatus 标记与制备

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甘油	Sigma	G6279	http://www.sigmaaldrich.com
T75 培养瓶	Greiner Bio-One	658 175	http://www.greinerbioone.com/
PBS	Gibco	20012-019	https://www.thermofisher.com/
吐温-80	Fisher Scientific	10592955	https://nl.fishersci.com/
40 µm 滤膜	Thermo Fisher Scientific	22363547	https://www.thermofisher.com/
15 ml Falcon 管	Greiner Bio-One	188 261	http://www.greinerbioone.com/
50 ml Falcon 管	Greiner Bio-One	227 261	http://www.greinerbioone.com/
MilliQ	Millipore	QGARD00R1	纳米纯水具有类似效果。http://www.merckmillipore.com/
生物素	Molecular Probes	B-6352	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
DMSO	Sigma	D5879	http://www.sigmaaldrich.com
链霉亲和素-AF633	Molecular Probes	S-21375	截至目前，AF633 是唯一经测试后在吞噬体中仍可见的荧光染料。https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
EDTA 抗凝采血管	Greiner Bio-One	455036	任何含抗凝剂的采血管均可使用，我们倾向于使用此方法，因其可获得稳定且高纯度的单核细胞，且操作简便。http://www.greinerbioone.com/en/start/
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03	http://www3.gehealthcare.com/
台盼蓝	Thermo Fisher Scientific	SV3008401	https://www.thermofisher.com/
HBSS	Gibco	14170112	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
CD14 磁珠	Myltenyi Biotec	130-050-201	也可使用其他单核细胞分离方法，但我们更偏好此方法，因其可在无需繁琐操作的情况下获得高纯度的单核细胞。http://www.miltenyibiotec.com/en/
MS 分离柱	Myltenyi Biotec	130-042-201	参见 CD14 磁珠的注释。http://www.miltenyibiotec.com/en/
RPMI + Glutamax	Gibco	72400-021	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
无 CO2 培养基	Thermo Fisher Scientific	18045054	若成像过程中 CO2 交换不足，则必须使用此培养基。https://www.thermofisher.com/uk/en/home
µ-slide 8 孔玻璃底培养板	Ibidi	80827	这是我们使用的成像培养皿，但任何尺寸合适的玻璃底成像皿均可使用。http://ibidi.com/
UltraVIEW VoX 3D 活细胞成像系统	Perkin Elmer	L7267000	包含用于图像采集与分析的 Volocity 软件。http://www.perkinelmer.com/