原代人类免疫细胞抗真菌活性的实时评估

摘要

来源：Brunel, S. F. 等，人原代中性粒细胞和单核细胞对A. fumigatus的抗真菌活性实时成像。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了利用荧光标记的Aspergillus报告分生孢子对人中性粒细胞抗真菌活性进行活细胞成像的分析方法。最初，中性粒细胞内可同时检测到红色和洋红色荧光，随着时间推移，红色荧光逐渐减弱，表明分生孢子被降解，从而证实了中性粒细胞具有抗真菌活性。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. A. fumigatus 培养与培养条件

1. 按所述方法制备葡萄糖最低限度琼脂培养基。
   1. 使用 1 M 氢氧化钠 (NaOH) 将培养基 pH 调至 6.5，并在 120 °C 下高压灭菌 20 分钟。
   2. 冷却至 65 °C。
   3. 在无菌操作台中，将 30 mL 冷却后的培养基倒入 T75 培养瓶中，并将瓶口置于 25 mL 移液管上，使培养基倾斜凝固形成斜面。
2. 将 dsRed Af293-Aspergillus fumigatus 菌株在琼脂斜面上划线接种，并于 37 °C、5% 二氧化碳 (CO₂) 条件下培养 7 天。两个培养瓶可获得约 10⁹  个分生孢子，悬浮于 5 mL 磷酸盐缓冲液 (PBS) 中，用于生物素标记前处理。

2. A. fumigatus 标记与制备

注意：首次进行此实验时，需准备亲本Af293-A. fumigatus 菌株。将两种菌株分别取样至微量离心管中，并仅对每种菌株中的一管按以下说明进行标记。这样可获得无颜色的对照分生孢子，以及单一颜色的分生孢子（分别为dsRed或Alexa Fluor 633（AF633）），用于测试实验设置和仪器设备。

1. 通过加入 30 mL PBS + 0.05% Tween-80 浸没培养物来收获 A. fumigatus 分生孢子。将所得悬液经 40 µm 细胞筛过滤至 50 mL 离心管中，以去除菌丝碎片。
2. 在 805 × g 条件下离心 10 分钟，弃上清液，并用 20 mL 无菌 PBS 洗涤一次。在洗涤步骤中合并来自两块相同菌株平板的分生孢子。
3. 洗涤后，将沉淀重悬于 5 mL PBS 中，并将 1 mL 分生孢子悬液分装至微量离心管中。每种菌株通常取 1 mL 悬液即可用于活细胞成像。将剩余分装样品用铝箔包裹，于 4 °C 保存。
4. 将分生孢子悬液分装样品在室温下以 9,300 × g 离心 10 分钟，小心弃去上清液。将分生孢子沉淀重悬于 1 mL 0.05 M 碳酸氢钠（NaHCO₃） pH 8.3 溶液中。
5. 通过将 25 mg 生物素溶于 500 µL 二甲基亚砜（DMSO）配制 10 mg 生物素/200 µL DMSO 储存液。向微量离心管中加入 10 µL 生物素/DMSO 储存液，用铝箔包裹，于 4 °C 摇床上孵育 2 小时。
   1. 将剩余的生物素/DMSO 储存液分装后于 -20 °C 冻存，供后续实验使用。
6. 以 9,300 × g 离心 10 分钟，小心弃去上清液。将分生孢子沉淀重悬于 1 mL 100 mM 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）pH 8.0 溶液中，孵育 1 小时以灭活游离生物素。
7. 以 9,300 × g 离心 10 分钟，小心弃去上清液。用 1 mL 无菌 PBS 洗涤沉淀两次，最后将沉淀重悬于 1 mL PBS 中。
8. 将 1 mg 链霉亲和素-AF633 溶于 0.5 mL PBS 中，配制成 2 mg/mL 储存液。每 1 mL 分生孢子悬液中加入 10 µL 2 mg/mL 链霉亲和素-AF633，于室温在铝箔包裹的摇床上孵育 40 分钟。剩余的链霉亲和素-AF633 可分装冻存，用于后续实验。
9. 以 9,300 × g 离心 10 分钟，小心弃去上清液。将分生孢子沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并用血细胞计数板在 1:1,000 稀释度（先 1:100，再 1:10）下计数分生孢子。用不含 CO₂ 的培养基将分生孢子浓度调整至 3.6 × 10⁶/mL，用铝箔包裹后于 4 °C 保存。
   注意： 此时分生孢子已标记 AF633，将被称为荧光 Aspergillus 报告系统（FLARE）分生孢子。
10. 可选： 若需使用膨胀分生孢子进行刺激，在完成分生孢子计数（步骤 2.9）后，将分生孢子用酵母氮源基础（YNB）培养基稀释至 7.2 × 10⁶/mL，并将 500 µL 分生孢子悬液加入含 4.5 mL YNB 培养基的灭菌 50 mL 锥形瓶中。盖好瓶口，置于摇床培养箱中（37 °C，200 rpm）孵育 6 小时。
    1. 将培养液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 805 × g 离心 10 分钟，并用 PBS 洗涤一次。再次离心后，将沉淀重悬于 1 mL 不含 CO₂ 的培养基中，得到浓度为 3.6 × 10⁶ 分生孢子/mL 的悬液。
       注意： 分生孢子在膨胀后常发生聚集，导致准确计数困难，建议根据初始静止状态分生孢子的计数结果进行计算。

3. 人中性粒细胞和单核细胞的分离

1. 从健康志愿者体内抽取20 mL静脉血，分别加入两个含有乙二胺四乙酸（EDTA）的10 mL采血管中。针对每位供体，将20 mL血液倒入一个50 mL离心管中，并加入15 mL磷酸盐缓冲液（PBS）稀释。
2. 用注射器和铁针将15 mL淋巴细胞分离液（密度1.077 g/mL）注入血液下方。将针头置于试管底部，缓慢推出淋巴细胞分离液。以630 × g离心20分钟，不启用刹车，加速度设为低速。
3. 制备预冷的 PBS，置于冰上。        
   注意： 步骤3.4和3.5必须同时进行，以分别生成单核细胞（3.4）和中性粒细胞（3.5）。
4. 使用移液管收集外周血单个核细胞（PBMC）层。该层位于上层黄色血清与下层透明淋巴细胞分离液之间的中间位置，将其转移至一个新的50 mL离心管中。
   1. 将PBMC用预冷的PBS补至50 mL，于582 × g离心10 min。弃上清，用预冷的PBS洗涤两次，按每20 mL初始献血者血液加入1 mL PBS的比例重悬细胞。
   2. 将20 µL细胞悬液加入160 µL PBS和20 µL台盼蓝中，制备1:10稀释液用于计数。使用血细胞计数板进行细胞计数。
   3. 通过将26 mL热灭活的胎牛血清（FCS）和2.1 mL 0.5 M EDTA加入500 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，配制缓冲液。将细胞以515 × g离心10分钟，并按每1 × 10⁶个细胞加入40 µL缓冲液的比例重悬细胞。⁷ 细胞
   4. 将细胞悬液转移至15 mL离心管中，每1 × 10⁷个细胞加入10 µL CD14磁珠⁷ 细胞，充分混匀，在 4 °C 孵育 15 分钟，每 5 分钟摇动混匀一次。
   5. 通过每 1 × 10⁶ 个细胞加入 1 mL 缓冲液洗涤细胞⁷ 细胞在515 × g离心10分钟。
   6. 吸弃上清液，完全去除后重悬至最多 1 x 10⁸ 500 µL 缓冲液中的细胞
   7. 根据制造商说明，将每个样品放置一个色谱柱于磁性分离架上。首先，用500 µL缓冲液将色谱柱洗涤一次。
   8. 用移液器将500 µL细胞悬液通过柱子，待柱子干燥后，再用缓冲液重复此操作洗涤三次。
   9. 将新的15 mL离心管置于柱下方，从磁力分离器上取下分离柱，然后用1 mL缓冲液将细胞从柱中冲洗至离心管中。
   10. 加入4 mL缓冲液，515 × g离心10分钟，然后重悬于1 mL Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基中。
   11. 将20 µL细胞悬液加入160 µL PBS和20 µL台盼蓝中，制备1:10稀释液用于计数。使用血细胞计数板进行细胞计数。
   12. 将细胞浓度调整至 6 x 10⁵/mL RPMI 培养基重悬，取 200 µL 接种至 35 mm 玻璃底成像培养皿中，37 °C、5% CO₂ 条件下培养过夜₂.
   13. 次日成像前，移除 RPMI 培养基，并加入 200 µL 无 CO2 培养基。
       注意： 这些单核细胞在成像前也可分化为多种巨噬细胞亚群。若拟探索该技术，可从Ohradanova-Repic近期发表的一篇优秀论文入手。 等
5. 收获PBMC层后，移除所有血清和大部分淋巴细胞分离液，但需小心不要移去红细胞沉淀物顶部的白色薄层，因为其中含有大部分中性粒细胞。
   1. 通过加入83 g氯化铵（NH₄Cl）制备10倍浓缩的低渗裂解缓冲液储备液₄Cl）和10 g碳酸氢钾（KHCO₃）₃) 在1升无菌水中溶解。4 °C保存。
   2. 将该储备液用无菌水稀释10倍后加入各试管中。然后轻轻颠倒混匀3次，冰上孵育15分钟。
   3. 在冰上以 394 × g 离心 10 分钟，然后在低渗裂解缓冲液中重悬 10 分钟。
   4. 在 394 × g 条件下离心，并用冷 PBS 洗涤两次。重悬于 1 mL CO₂每位供体的非依赖性培养基
   5. 将20 µL细胞悬液加入160 µL PBS和20 µL台盼蓝中，制备1:10稀释液用于计数。使用血细胞计数板进行细胞计数。
   6. 对于显微镜观察，将200 µL相同细胞悬液加入35 mm玻璃底成像培养皿中。   
      注意: 由于中性粒细胞在未受刺激时易于发生凋亡，因此应立即进行成像或流式细胞术检测。若无法立即检测，应将中性粒细胞置于冰上保存，并尽快使用（同一天内）。

4. 活细胞视频显微镜技术

注意：显微镜的选择取决于本地可用的设备，但显微镜配置必须包含倒置镜台、维持在 37 °C 的环境培养室，以及适用于 dsRed（532/561 nm）和 AF633（633 nm）的适当激发/发射滤光片。 FLARE 分生孢子不能使用 488 nm 激光替代 532/561 nm 激光来检测 dsRed。首次进行此实验时，应使用无荧光标记的对照分生孢子以及单色标记的分生孢子，以检测 dsRed 与 AF633 通道之间的背景荧光及荧光串扰。

1. 实验前打开显微镜加热器，并留出足够时间使环境控制腔室升温至 37 °C。不同显微镜系统的腔室温度稳定所需时间可能有所不同。
2. 打开显微镜和计算机，启动成像软件。将成像培养皿安装到显微镜载物台上，并调节焦距以找到人中性粒细胞或单核细胞。
3. 对于 dsRed 和 AF633，将采集设置中的激光功率设为 10%，曝光时间设为 1 秒。
4. 取下成像载片，向相应孔中加入 100 µL 浓度为 3 × 10⁶/mL 的 FLARE 分生孢子悬浮液（每孔总体积为 300 µL）。记录 FLARE 分生孢子加入培养皿的时间。
5. 将载片放回载物台，调节 dsRed 和 AF633 的相机灵敏度，以清晰观察分生孢子但不使图像过曝。如需多点采集，设置载物台点位列表。
6. 当所有点位均已聚焦、各通道参数优化完毕，且循环时间和成像持续时间设定后，开始成像。成像的循环时间和持续时间取决于具体实验问题。目标是使循环时间尽可能短（≤2 分钟），1 分钟的循环时间可支持对吞噬动力学进行深入分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甘油	Sigma	G6279	http://www.sigmaaldrich.com
T75 培养瓶	Greiner Bio-One	658 175	http://www.greinerbioone.com/
PBS	Gibco	20012-019	https://www.thermofisher.com/
吐温-80	Fisher Scientific	10592955	https://nl.fishersci.com/
40 µm 滤膜	Thermo Fisher Scientific	22363547	https://www.thermofisher.com/
15 ml Falcon 管	Greiner Bio-One	188 261	http://www.greinerbioone.com/
50 ml Falcon 管	Greiner Bio-One	227 261	http://www.greinerbioone.com/
MilliQ	Millipore	QGARD00R1	纳米纯水具有类似效果。http://www.merckmillipore.com/
生物素	Molecular Probes	B-6352	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
DMSO	Sigma	D5879	http://www.sigmaaldrich.com
链霉亲和素-AF633	Molecular Probes	S-21375	截至目前，AF633 是唯一经测试后在吞噬体中仍可见的荧光染料。https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
EDTA 抗凝采血管	Greiner Bio-One	455036	任何含抗凝剂的采血管均可使用，我们倾向于使用此方法，因其可获得稳定且高纯度的单核细胞，且操作简便。http://www.greinerbioone.com/en/start/
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03	http://www3.gehealthcare.com/
台盼蓝	Thermo Fisher Scientific	SV3008401	https://www.thermofisher.com/
HBSS	Gibco	14170112	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
CD14 磁珠	Myltenyi Biotec	130-050-201	也可使用其他单核细胞分离方法，但我们更偏好此方法，因其可在无需繁琐操作的情况下获得高纯度的单核细胞。http://www.miltenyibiotec.com/en/
MS 分离柱	Myltenyi Biotec	130-042-201	参见 CD14 磁珠的注释。http://www.miltenyibiotec.com/en/
RPMI + Glutamax	Gibco	72400-021	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
无 CO2 培养基	Thermo Fisher Scientific	18045054	若成像过程中 CO2 交换不足，则必须使用此培养基。https://www.thermofisher.com/uk/en/home
µ-slide 8 孔玻璃底培养板	Ibidi	80827	这是我们使用的成像培养皿，但任何尺寸合适的玻璃底成像皿均可使用。http://ibidi.com/
UltraVIEW VoX 3D 活细胞成像系统	Perkin Elmer	L7267000	包含用于图像采集与分析的 Volocity 软件。http://www.perkinelmer.com/