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利用珠载脂质双层研究T细胞的突触输出

2025年7月8日

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

来源：Céspedes, P. F., 等 制备珠载脂质双层以研究T细胞免疫突触的颗粒输出。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了通过珠载脂质双层膜重建合成抗原呈递细胞的方法，及其在评估活化T细胞所产生突触输出中的应用。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. BSLB（珠载脂质双层）上蛋白质密度的校准

  1. 在取用直径为5.00 ±0.05 µm的非功能化二氧化硅微珠前，需充分混匀储备液，并重新悬浮烧瓶底部沉积的大块微珠聚集体。
    注意硅胶珠容易快速沉降，可能导致计数误差。使用P1000移液器吸取最大体积的一半，反复吹打混匀。
  2. 将1 µL珠溶液加入1,000 µL PBS中稀释，使用血细胞计数板计数珠子数量，并计算每毫升的浓度。
    注意： 台盼蓝染色无需用于观察二氧化硅微珠。
  3. 计算所需二氧化硅珠的体积，以达到 5 × 105 滴定每一点的最终BSLBs。
  4. 将所需体积的二氧化硅珠转移至无菌的1.5 mL微量离心管中。
  5. 用1 mL无菌PBS洗涤硅胶珠3次，在室温下使用台式微量离心机以固定转速离心15秒。
    注意：移除洗涤液时，避免扰动磁珠沉淀。由于脂质体母液中的脂质体也处于PBS中，因此残留少量缓冲液不会影响脂质体的分散。
  6. 准备三倍体积的脂质体主混合液，用于在洗涤后的二氧化硅微珠上组装 BSLB（例如，如果二氧化硅微珠的初始总体积为 20 µL，则至少准备 60 µL 的脂质体主混合液）。
  7. 用于Biotinyl Cap PE摩尔百分比滴定
    1. 制备含有5倍稀释Biotinyl Cap PE的脂质主混合液。
      1. 将0.4 mM Biotinyl Cap PE mol%稀释于100% DOPC基质中。
      2. 将每个生物素化帽PE的摩尔百分比滴定梯度与0.4 mM含25% DGS-NTA(Ni)的溶液按1:1（体积:体积）比例混合，使所有滴定体系中镍脂质的终浓度均为12.5 mol%。
        注意： 含镍脂质占12.5 mol%（体积比%）代表了BSLBs的混合脂质组成，可用于并行校准实验中对His标签蛋白进行测试。例如，由于所有脂质体储备液均以相同的摩尔浓度配制，在200 µL终体积的脂质体混合液中，只需将100 µL的25 mol%含镍DGS-NTA与100 µL的100 mol% DOPC混合，即可获得目标mol%的混合物。
    2. 转移 5 × 105 将洗涤后的二氧化硅珠加入1.5 mL微量离心管中，每管组装一个生物素化帽PE mol%滴定点。
    3. 将不同摩尔百分比的生物素化帽PE（Biotinyl Cap PE）滴定主混合液加入洗涤后的二氧化硅微珠中，用移液器轻轻吹打混合，吹打体积为总反应体积的一半。避免产生气泡，过多的气泡会破坏脂双层结构。
    4. 向含有正在形成的BSLBs的试管中通入氩气（或氮气），以置换空气，防止混合过程中脂质发生氧化。
    5. 储存前向0.4 mM脂质储备液中加入氩气，并采用无菌技术操作。
      注意： 将一小段管路连接至氩气/氮气气瓶。在向管中通入气体前，调节气瓶减压阀，使压力不超过2 psi。在出口管路末端连接一个无菌移液器吸头，将气体流导入脂质体储备液中持续5秒，随后迅速盖紧管盖。对于脂质储备液，储存于4 °C前，需先用石蜡膜密封管盖。
    6. 将BSLBs转移至垂直可调角度的实验室混匀仪中（参见 材料表）并在室温下以10 rpm的转速振荡混合30分钟。
      注意： 此步骤可防止在支撑脂质双层形成过程中微珠发生沉降。
    7. 在室温下使用台式小型离心机离心15秒，使磁珠沉淀，然后用1 mL HBS/HSA（BSA）洗涤三次，以去除多余的脂质体。
    8. 通过加入含有100 µM NiSO₄的1 mL 5% 乳酪素或5% BSA封闭已形成的BSLBs4 以饱和NTA位点，并加入200 nM链霉亲和素以均匀包被BSLB上的所有生物素锚定位点。用移液器轻轻吹吸总体积的一半进行混匀，然后在垂直混合器中孵育 室温下不超过20分钟 和 10 rpm。
    9. 在台式小型离心机上，于室温下离心15秒，使BSLB沉淀，然后用1 mL HBS/HSA（BSA）缓冲液洗涤三次。
      注意： 将洗涤后的磁珠垂直放置，加入少量洗涤缓冲液以覆盖BSLBs，避免BSLBs脱水，因为暴露于空气中会破坏脂质双层。
  8. 对于在含12.5 mol% DGS-(Ni)NTA的BSLB上滴定His标签蛋白
    1. 制备三份脂质体主混合液，其中 DGS-NTA(Ni) 的终浓度为 12.5 mol%。
    2. 使用脂质体母液重悬洗涤后的二氧化硅珠，通过移液枪轻轻吹打总体积的一半进行混匀。避免产生气泡，过多的气泡会破坏脂质双分子层。
    3. 在含有正在形成的BSLBs的试管中通入氩气（或氮气），以置换空气，防止混合过程中脂质发生氧化。
    4. 储存前向0.4 mM脂质储备液中加入氩气，并采用无菌技术操作。
    5. 将BSLBs转移至垂直混合器中，在室温下以10 rpm的转速进行轨道混合，持续30分钟。
    6. 在室温下使用台式小型离心机离心15秒，使磁珠沉淀，然后用1 mL HBS/HSA（BSA）洗涤三次，以去除多余的脂质体。
    7. 通过加入1 mL含100 µM NiSO4的5%酪蛋白（或5% BSA）溶液封闭已形成的BSLBs，以饱和BSLBs上的NTA位点。轻轻混匀，并在垂直混合器中孵育 室温下不超过 20 分钟 和 10 rpm。
    8. 用 HBS/HSA（BSA）洗涤三次，以去除多余的封闭液。
    9. 在新的U型底96孔板中，对蛋白质进行2倍系列稀释。
      1. 将目标蛋白用 HBS/HSA (BSA) 缓冲液配制至起始浓度为 100 nM，总体积为 200 µL，取其中 100 µL 加入第一根柱子，剩余 100 µL 加入含有 100 µL HBS/HSA (BSA) 缓冲液的第 2 根柱子顶部。
      2. 继续将100 µL液体从第2列依次转移至第3列，并依此操作重复进行，直至覆盖所有滴定点。系列的最后一列不加蛋白质，作为空白对照，用于后续定量分析。
    10. 将制备好的BSLB重悬于一定体积的溶液中，使每5 × 105 BSLBs 保存在 100 µL HBS/HSA（BSA）缓冲液中。
    11. 将100 µL BSLB悬浮液转移至另一块U型底96孔板的各孔中，使每孔含有5 × 105 BSLBs
    12. 离心含有BSLBs的第二块平板，300 × g，2分钟 g 室温下离心并弃去上清液。
    13. 将蛋白滴定板中的100 µL液体转移至含有沉淀BSLBs的板中。轻轻混匀，移液时避免产生过多气泡，然后在室温下以1,000 rpm于板式振荡器中孵育30分钟。用铝箔避光保护。
    14. 用 HBS/HSA（BSA）缓冲液洗涤平板三次，每次离心条件为 300 × g 室温下持续2分钟。
    15. 如果用于校准的重组蛋白直接与荧光染料偶联，且具有已知的荧光染料/蛋白比值（F/P值）。
    16. 如果校准所用的重组蛋白未标记或与荧光染料偶联，或无MESF微球标准品，可使用已知F/P值的Alexa Fluor 488或647偶联抗体对包被蛋白的BSLB进行染色。
    17. 使用定量抗体的饱和浓度进行染色。
      注意：根据目标表达水平，其范围在5到10 µg/mL之间。
    18. 室温下使用平板摇床染色30分钟，转速为1,000 rpm。用铝箔包裹避光。
    19. 用 HBS/HSA（BSA）缓冲液洗涤两次，用 PBS 洗涤一次，每次均采用 300 × g 离心步骤 g 室温下持续2分钟。
      注意： 使用 pH 7.4 的 PBS 重悬洗涤后的 BSLB，采集前勿使用含蛋白质的缓冲液，因为这会导致高通量进样器自动混样过程中产生气泡。
    20. 获取MESF标准品，确保最亮的峰仍处于定量检测器（通道）的线性检测范围内，如图所示 图1B (vii).
    21. 手动或使用高通量筛选系统（HTS）采集样品。若采用后者，将BSLBs重悬于100 µL PBS中，以2.5至3.0 µL/s的流速吸取80 µL，混悬体积设为100 µL（若重悬体积不足，则设为总体积的50%），混悬速度为150 µL/s，进行五次混悬，以确保BSLBs呈单分散状态。
    22. 导出 FCS 文件。
    23. 分析时关注单个事件（图 2A），因为双联或三联事件会在测定中引入误差。请按照方案步骤1.2.3中所示，采用嵌套式单事件识别方法。
    24. 测量每个MESF组分（1-4）的MFI，并减去空白微球的MFI，以获得校正后的MFI（cMFI）。
    25. 进行线性回归分析以提取斜率（bMESF 标准品的 cMFI 计算所得的 MESF 值。
    26. 提取每个滴定终点的MFI，并减去不含蛋白质的磁珠的MFI，以获得校正后的MFI（cMFI）。
    27. 将cMFIs除以计算得到的斜率，以提取每个滴定点结合到BSLBs上的MESF值。
    28. 将结合到BSLB上的MESF值除以定量抗体的F/P值，以计算每个BSLB上结合的分子平均数量。
    29. 利用BSLBs的直径（5.00 ± 0.05 µm），计算微球表面积（SA = 4πr²），以确定蛋白的最终密度（分子/µm²）2每滴定终点（蛋白质浓度）
    30. 执行一次新的回归分析 蛋白浓度 结束 蛋白质密度 计算最佳拟合直线的斜率（b）。
      注意： 12.5 mol% 的 DGS-NTA(Ni) 浓度可提供约 10,000 个分子/µm² 的最大锚定容量，同时不会诱导 T 细胞的非特异性活化，也不影响支持性脂双层（SLBs）的侧向流动性。

2. 在T细胞与BSLB之间进行突触转移实验

  1. 在进行突触传递实验之前
    1. 获取非荧光BSLBs、含荧光脂质的BSLBs、未染色细胞（或补偿微珠；参见原文） 材料表，并使用单色标记的细胞（或补偿微珠）来识别仪器的荧光光谱相互干扰情况。重点关注那些存在显著溢出扩散的检测通道，以重新设计多色检测方案，提高检测灵敏度，并降低关键检测通道的测量误差。
    2. 滴定检测抗体以确定最佳浓度，从而在确保阳性信号检测的同时不影响阴性信号的检出。
      注意： 每次更换抗体批次时均需重复此步骤，因为不同批次间的F/P值和荧光亮度存在差异。
    3. 可选：通过在不同电压范围（即电压梯度扫描）下采集样本，优化光电倍增管（PMT）电压，以确定可实现最佳信噪比的PMT设置（即有效区分阴性和阳性信号，同时确保最强荧光信号群体的信号处于线性检测范围内）。
  2. T细胞输出量向BSLBs转移的测定
    1. 配制添加了以下成分的RPMI 1640培养基（以下简称R10培养基）：10% 经热灭活的胎牛血清（FBS）、100 µM 非必需氨基酸、10 mM HEPES、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、100 U/mL 青霉素和100 µg/mL 链霉素。使用R10培养基进行T细胞的培养与扩增。
    2. 开启 第1天，从外周血或白细胞减少系统（LRS）滤芯中分离T细胞。使用免疫密度细胞分离与分选试剂盒（参见 材料表用于富集人CD4+和CD8+ T细胞。
    3. 以终浓度为 1.5 × 10⁶ 至 2.0 × 10⁶ 个细胞/mL 接种细胞6 细胞/mL，使用6孔板，每孔总体积不超过5 mL。
    4. 使用人T细胞活化（抗CD3/抗CD28）磁珠，按1:1比例活化T细胞（参见 材料表加入100 IU的重组人IL-2以促进细胞增殖与存活。
    5. 开启 第3天，使用磁性柱去除活化磁珠（参见 材料列表）。在进行后续洗涤步骤前，确保磁珠仍吸附在管壁上。
    6. 用 5 mL 新鲜 R10 培养基再次洗涤磁珠，充分混匀后置于磁铁上。回收上清液，并与步骤 1.2.5 中回收的细胞混合。
    7. 将细胞重悬至 1.5-2 × 106 细胞/mL，补充含有100 U/mL IL-2的新鲜R10培养基。48小时后更换培养基，并确保最后一次添加IL-2是在实验当天前48小时（培养第7至14天）。
    8. 在突触转移实验当天，准备 突触传递检测培养基 通过在不含酚红的 RPMI 1640 培养基中添加 10% 胎牛血清、100 µM 非必需氨基酸、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素进行配制。不要加入重组人 IL-2。
    9. 使用台盼蓝染色法或电流排斥法计数细胞，并将细胞重悬至终浓度为 2.5 × 106 细胞/mL。若观察到大量细胞死亡（>10%），使用多糖和碘酞酸钠混合物去除死亡/将死细胞（参见 材料表如下所示：
      1. 在13 mL多糖-二碘替酸钠溶液上层加入15 mL细胞培养液。
      2. 离心 1,250 × g 在室温下以最小加速度和减速度离心20分钟。收集位于培养基与多糖-泛影酸钠溶液界面处的细胞层（云雾状）。
      3. 用预热的突触传递检测培养基（按步骤1.2.7制备）至少洗涤细胞两次。
      4. 计数并重悬细胞，使其最终浓度为 2.5 × 106/mL 的突触传递检测培养基重悬细胞。取100 µL该细胞悬液与BSLBs共培养（见步骤1.2.15）。
    10. 计算实验所需的 BSLB 数量；需考虑所有待测试的不同蛋白质主混合物以及抗原梯度稀释组（包括生物素化 HLA/MHC-肽单体或单生物素化抗 CD3ε Fab）。
    11. 按照第5部分方案中的相同步骤组装BSLBs，但此次需混合所有用于重建复杂APC膜所需的蛋白质和脂质滴定组分。图3A). 在校准过程中，保持初始二氧化硅微珠体积与蛋白质混合物体积之间的相同体积比，以及在BSLB加样过程中使用的时间和温度条件。例如，若初始校准使用0.5 µL二氧化硅微珠/孔和100 µL/孔蛋白质混合物，则在制备与T细胞共培养的BSLB时，应维持5:1,000的体积比（vol:vol）。
    12. 将BSLBs与目标蛋白混合物孵育后，用HBS/HSA（BSA）洗涤BSLBs两次，以去除未结合的过量蛋白。采用300 × g的沉降速度进行洗涤。 g 每次洗涤步骤在室温下持续2分钟，并弃去上清液。
    13. 将每孔 5 × 105 个 BSLBs 重悬于 200 µL 中。
    14. 将每孔100 µL转移至新的U型底96孔板，制备复孔，使每孔BSLB的最终量为2.5 × 105.
    15. 以 300 × g 离心 BSLB g 2分钟，室温孵育，弃上清液。
    16. 使用100 µL T细胞悬液重悬BSLBs，轻轻混匀以防止气泡产生。
    17. 在37 °C下将共培养物孵育90分钟。
      注意： 或者，细胞和磁珠可重悬于HBS/HSA（BSA）缓冲液中，以替代酚红-free RPMI进行共培养。此种情况下，孵育必须在非CO₂环境下进行2 培养箱，因为这种气体会在缺乏碳酸氢盐的情况下迅速使缓冲液酸化。
    18. 将BSLB-T细胞共培养物置于室温下避光孵育至少15分钟，使其冷却。
    19. 将细胞在500 × g条件下离心5分钟 g 以及 RT；弃去上清液。
    20. 用室温的 2% BSA-PBS（含 Ca）重悬细胞2+ 和 Mg2+-游离）用于封闭。将细胞置于冰上孵育45分钟，避光。
    21. 孵育细胞的同时，使用冰上预冷的、经0.22 µm滤膜过滤的含2% BSA的PBS作为染色缓冲液配制抗体主混合液，以提供额外的封闭效果。
      注意： 某些批次的与 Brilliant Violet 染料偶联的抗体容易非特异性地结合到 BSLBs 上。使用 5% BSA-PBS 封闭有助于降低这种背景信号。 从现在起，务必确保冷链不断链.
    22. 以 500 × g 5 分钟，4 °C。弃上清前，使用背光检查 96 孔板底部，确认沉淀存在。
    23. 使用多通道移液器，将细胞重悬于含有优化抗体浓度的染色主混合液中。
      注意： 使用无滤芯的移液器吸头，以防止产生气泡及染色液体分配误差。
    24. 包括同型标记细胞和BSLBs、荧光标记与非荧光标记的BSLBs，以及单独染色的细胞和BSLBs。所有对照组需保持每孔总事件数一致（即仅含5 × 10⁴个BSLBs）。5 每孔BSLB，仅含5 × 10的细胞对照5 每孔细胞数，以避免每个染色事件的抗体相对增加）。
    25. 用移液器轻轻吹打混合，体积为原体积的一半，冰上孵育30分钟。避光。
    26. 用预冷的2% BSA-PBS（pH 7.4）洗涤细胞和BSLBs两次，每次离心条件为500 × g 4 °C下离心5分钟。用100 µL PBS重悬洗涤后的共培养物，并立即上机检测。
    27. 如果需要固定，用含0.5% w/v PFA的PBS溶液固定10分钟，洗涤一次，随后保存于PBS中直至检测。避光保存。
    28. 补偿前，获取MESF标准，确保最暗和最亮的细胞群均落在测量的线性范围内。
    29. 获取补偿样本，计算补偿，并将补偿矩阵（链接）应用于实验。
    30. 获取并保存至少 2 × 104 每种定量通道的总MESF标准品
    31. 使用高通量采样器进行采集将仪器采集模式设为标准，样本采集量设为 80 µL（或总体积的 80%），样本流速控制在 2.0 至 3.0 µL/s 之间，样本混匀体积设为 50 µL（或总体积的 50%，以避免混匀过程中产生气泡），混匀流速设为 150 µL/s，每孔混匀次数设定在 3 至 5 次之间。
    32. 至少获取 1 × 104 每个样本一个BSLB（参见 图3B 参考门控策略的图示 (i)-(vi) 面板。
    33. 关闭仪器前，先用清洗液冲洗流式细胞仪5分钟，再用超纯水冲洗5分钟。若使用HTS，请在选项卡下选择相应操作。 高通量筛选与洁净 选项
    34. 导出 FCS 文件。

3. 测量颗粒向BSLBs的突触传递

  1. 打开实验的 FCS 文件。根据细胞和 BSLB 的侧向散射光与前向散射光区域（SSC-A 与 FSC-A），选择细胞和 BSLB 群体，如图 3B（i）所示。
  2. 选择连续采集时间窗口内的事件（图 3B（ii））。
  3. 聚焦于细胞和 BSLB 的单个事件；首先根据 FSC-W/FSC-H 连续设门中的低脉宽信号（单一群体-1，图 3B 面板（iii））和 SSC-W/SSC-H（单一群体-2；图 3B 面板（iv））识别单个细胞。通过选择 FSC-A 与 FSC-H 呈比例关系的事件，定义额外的单一群体-3 门（图 3B，面板（v））。
  4. 提取每个实验样本中空白及 MESF 分级 1 至 4 的 MFI 值，以及单个细胞和 BSLB 的 MESF 的 MFI 值。
  5. 通过从各分级中减去空白微球群体的 MFI，计算 MESF 分级 1 至 4 的校正 MFI（cMFI）值。
  6. 计算单个 BSLB 和细胞的 cMFI 值（参见图 3C 面板（i））。
  7. 利用经同型对照抗体染色的 BSLB 信号，校正经针对相关 T 细胞标志物抗体染色的 BSLB 的 MFI。使用 cMFI 并依据图 3C 面板（ii）所示公式，计算归一化的突触转移百分比（NST%）。
  8. 若关注的是因 TCR 激活而特异性转移的颗粒，则从激动性 BSLB 的 MFI 中减去空载 BSLB 的信号。使用该 cMFI 并依据图 3C 面板（ii）所示公式，计算TCR 驱动的 NST%。
  9. 若需确定在 T 细胞-BSLB 界面间作为颗粒载荷转移的分子总数，请使用与 T 细胞-BSLB 共培养相同的仪器设置和采集会话获取 MESF 标准微球数据。
  10. 分析 MESF 微球群体并提取其 cMFI 值。对 MESF 与 cMFI 的回归分析，计算最佳拟合直线的斜率。
  11. 利用计算所得的斜率，推算沉积在 BSLB 上的 MESF 数量。使用以同型对照或空载 BSLB 作为空白所计算的 cMFI，推算特异性转移至刺激性 BSLB 的 MESF 数量。
  12. 通过将每 BSLB 计算所得（平均）MESF 数除以定量抗体的 F/P 值，计算转移至 BSLB 的标志物分子数量。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

显示 ICAM-1 表达的流式细胞术数据分析；包含多种设门策略和图表。
图 1：抗原呈递细胞表面蛋白的绝对定量。（A）扁桃体 B 细胞（Foll. Bc）和滤泡辅助性 T 细胞（TFH）表面 ICAM-1 定量流式细胞术检测示例。（i–vii）从人腭扁桃体中分离的单个 CXCR5+ B 细胞（Bc）和 TFH 细胞的设门策略。图中显示了识别获取连续窗口内单个活细胞事件的逐级设门流程。（iii–iv） 黑色箭头指示双联体（doublets）。（viii）叠加直方图显示目标细胞群（见 vii）表面 ICAM-1 表达（青色直方图）与 FMO 对照（灰色直方图）以及用相应同型对照标...

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔 U 型底细胞培养板，带盖，经组织培养处理，无热原Costar®3799用于 BSLB 与细胞的流式细胞术染色及共培养。
96 孔 V 型底细胞培养板，带盖，经组织培养处理，无热原Costar®3894用于悬浮状态下的细胞或微珠的流式细胞术染色。
Alexa Fluor 488 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™A20000
Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™A37573 和 A20006
6 孔多孔板，经真空气体等离子体处理，适用于组织培养Falcon353046用于纯化后的 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的培养与扩增。
牛乳酪蛋白，适用于蛋白激酶底物（去磷酸化后），纯化粉末
Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28ThermoFisher Scientific, Gibco11132D
DynaMag-2ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12321D用于体积小于 2 mL 的 Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28 的去除
DynaMag™-15ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12301D用于体积小于 15 mL 的 Dynabeads™ 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28 的去除
经认证的胎牛血清，One ShotThermoFisher Scientific, GibcoA3160801需在 56 °C 下热灭活 30 分钟
抗人 CD154（CD40L），克隆号 24-31BioLegend310815 和 310818分别为 Alexa Fluor 488 和 Alexa Fluor 647 偶联物
Armenian Hamster IgG Alexa Fluor 647 同型对照，克隆号 HTK888BioLegend400902使用 Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）在本实验室标记
BD 流式细胞仪校准与追踪微珠Becton Dickinson & Company (BD)641319在进行定量流式细胞术前对仪器性能进行追踪

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T MHC

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