一种用于评估细菌来源抗菌化合物效应的延迟生长抑制试验

摘要

来源：Moran, J. C. 等，延迟生长抑制实验定量分析细菌来源抗菌物质对竞争的影响。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了延迟生长抑制试验，该方法用于研究一种细菌产生的抗菌化合物如何影响另一种竞争性细菌菌株的生长。

方案

以下方法适用于检测竞争菌株与产抑制剂菌株的相互作用。

注意：本实验方案涉及细菌培养物的气溶胶生成，必须在具备经当地批准的安全防护措施的密闭空间内进行。在二级生物安全柜内将菌液喷洒至琼脂平板，可最大限度减少琼脂平板及周围环境的污染，同时保护研究人员避免吸入喷雾产生的细菌气溶胶，这一点在使用二级生物安全等级微生物时尤为重要。操作人员必须穿戴适当的个人防护装备。建议用一次性吸水纸覆盖培养皿周围区域。喷雾操作后建议使用紫外灯进行去污染处理。

1. 准备琼脂平板

1. 根据制造商说明配制脑心浸出液（BHI）琼脂。
2. 将BHI琼脂在121 °C、15磅力每平方英寸（psi）条件下高压灭菌20分钟，或按照高压灭菌器制造商的建议进行灭菌。
3. 将15 ml无菌BHI琼脂分装至无菌培养皿中，静置使其凝固。
   注意：确保实验中使用的所有琼脂平板均来自同一批次的琼脂，并且每个平板中的琼脂量相同。这可以限制平板间营养物质的差异和抑制剂扩散的变异性，从而保证结果的可比性。

2. 准备无菌肉汤

1. 根据生产商说明书配制BHI肉汤。
2. 将10 ml的BHI分装至28 ml玻璃广口瓶中。
3. 在121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟，或按照高压灭菌锅生产商的建议进行灭菌处理。
   注意：确保实验中使用的所有肉汤均来自同一批次、同时灭菌的培养基，以减少因营养成分差异导致实验结果波动。

3. 准备无菌雾化瓶

1. 拆卸汽化瓶。
2. 将5%表面活性清洁剂通过汽化器喷入，以清除内部污染物，并将汽化瓶、瓶盖和汽化器浸泡于5%表面活性清洁剂中过夜。
   注意：操作表面活性清洁剂时应佩戴手套及适当的个人防护装备。
3. 在无菌气流罩下干燥汽化器、瓶盖和瓶子。
4. 向瓶中加入70%乙醇，重新安装汽化器，并通过汽化器喷出部分乙醇。
5. 将瓶盖盖在汽化器上，使乙醇保留在瓶内，直至使用。
6. 使用前立即用无菌BHI肉汤无菌冲洗瓶子，并通过汽化器喷出肉汤。
   注意：此举可防止乙醇影响6.3节中加入瓶内的接种物。

4. 准备细菌过夜培养物

1. 将竞争菌株和抑制菌株划线接种至无菌的BHI琼脂平板上，在37 °C有氧条件下培养约18小时（过夜）。
   注意：该平板可制备细菌储备液，若在4 °C保存，可在同一周内用于多次重复实验。
2. 在28 ml通用瓶中，用单个菌落接种10 ml无菌BHI液体培养基中的目标竞争菌株。
3. 将通用瓶置于37 °C有氧条件下，在旋转摇床中以250 rpm振荡过夜培养。

5. 产抑制物菌株的点培养

1. 按照第4节所述方法制备过夜培养物。
2. 确保琼脂平板在接种前完全干燥，皿盖上无冷凝水。例如 通过在37 °C条件下孵育平板60分钟；这可以防止接种物从接种部位向平板其他区域扩散。
3. 用移液器将25 µl过夜培养物加到琼脂平板的中心。避免完全按压移液器推杆，以防产生气泡导致培养物飞溅至琼脂表面。
4. 室温下晾干培养物以限制其扩散。将琼脂平板在37 °C有氧条件下孵育过夜。

6. 准备测试竞争菌株的喷雾接种液

1. 按照第4节所述方法制备过夜培养物。将过夜培养物用BHI肉汤稀释10倍，得到浓度约为4 x 10⁶ 菌落形成单位 (CFU) ml^-1、OD₆₀₀ 为0.3 ±0.05的菌悬液。
   注意：并非所有细菌种类经10倍稀释后均可达到4 x 10⁶ CFU ml^-1，应通过将1 x 10^-1 至1 x 10^-6 的系列稀释液进行涂布平板法计数，计算所需的稀释倍数。
2. 将稀释后的菌液倒入无菌塑料喷雾瓶中。
   注意：总体积应多于待喷洒的琼脂平板所需用量。每个9 cm直径的培养皿约需250 µl。

7. 延迟生长抑制试验

1. 将培养物通过每个喷雾瓶喷出，以确保在将培养物喷洒到琼脂表面之前，喷雾装置中已加载了培养物。
2. 从距离琼脂表面约15 cm的高度，将约250 µl稀释后的培养物（典型50 ml喷雾瓶喷3次）均匀喷洒在整个琼脂表面。将琼脂平板置于37 °C有氧条件下过夜培养。对其他平板重复相同操作，喷洒次数保持一致。

8. 解读延迟生长抑制试验结果

1. 测量喷洒的竞争菌株的生长抑制圈（图1A-C，“X”到“X”）的直径（单位为毫米），并减去抑制物产生菌中央菌点的直径（图1A-C，“Y”到“Y”）。
   注意： 图1E 展示了该数据可能的呈现方式
2. 记录抑制圈的清晰度评分。
   注意： 该评分表示观察到的抑制程度。图1A-D 展示了示例，代表性结果部分建议了可用于标准化的菌株。可采用以下标准进行清晰度评分：评分为0表示竞争菌株的生长被完全抑制；评分为1表示生长几乎被完全抑制，仅在澄清区中存在个别菌落；评分为2表示可见生长减弱区域，该区域内的菌落呈融合或接近融合状态，但密度减少超过>50%；评分为3表示仅有轻微生长抑制，菌落仍呈融合状态，密度减少不足50%，且抑制圈仍可见并可测量；评分为4表示无可见的生长抑制；评分为5表示竞争菌株在待测抑制物产生菌附近生长增强。示例见图1。这些评分依赖于实验人员的主观判断。

结果

图 1： 延迟生长抑制试验可获得的定性与定量结果范围。 生长抑制的结果可从（A）完全抑制（评分为 0）、（B）部分抑制（评分为 1）、（C）部分抑制（评分为 2）到（D）无抑制（评分为 4）不等。标签标示了抑制菌株（Y）的生长边缘以及抑菌圈最外缘（X）。抑菌圈的大小范围从 0 mm 到超过 10 mm，如（E）所示，该图展示了对 A、B、C 和 D 中拍摄的平板所测量的结果。结果显示了近期分离的葡萄球菌...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑心浸液肉汤	Lab M	lab049	营养丰富的通用培养基
琼脂	Merck Milipore	101614
培养皿	Sarstedt	82.1473.001
塑料香水喷雾瓶	未知	-	高10 cm、直径3.5 cm的透明塑料喷雾瓶，带盖，购自超市旅行用品区
通用瓶		已停产，可选用替代品 SLS BOT5006	28 ml 玻璃圆柱形瓶（直径约280 mm，高850 mm），平底，带塑料螺旋盖
Decon 90	Decon		表面活性清洁剂