一种定量检测感染性原代巨噬细胞中胞质与液泡内Salmonella的实验方法

摘要

来源：Meunier, E., 等。通过差异性通透化定量分析原代巨噬细胞中胞质与囊泡内沙门氏菌的数量。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种利用差异性通透化方法定量骨髓来源巨噬细胞内胞质和液泡中Salmonella typhimurium的实验方法。巨噬细胞被表达荧光蛋白的Salmonella感染，细菌被内化至一种特化的液泡结构中，称为含Salmonella液泡（SCV）。部分细菌可从SCV中逃逸并进入胞质。利用皂苷（digitonin）处理可选择性通透富含胆固醇的巨噬细胞质膜，而SCV结构保持完整。随后使用荧光标记抗体对胞质内的细菌进行标记，再通过荧光激活细胞分选技术（FACS）定量液泡内和胞质中的细菌比例。

方案

1. 表达mCherry的皂苷素检测 沙门氏菌 （基于FACS的分析）

1. 准备细菌
   注意：本实验使用表达 mCherry 的野生型 Salmonella SL1344（链霉素抗性），该菌株携带编码 mCherry 的质粒（pFPV，mCherry 由 rpsM 启动子驱动表达）。组成型表达 mCherry 不影响细菌的吞噬和增殖能力（数据未显示）。
   1. 感染前一天，在 3 ml LB 培养基中接种菌株，加入链霉素（90 µg/ml）和氨苄青霉素（100 µg/ml，用于 mCherry 表达载体），37 °C 摇床过夜培养。
2. 为感染铺板细胞。
   1. 将野生型 BMDM 以 1.25 × 10⁵ 个细胞/孔的密度接种于 24 孔板中，每孔加入 1 ml 原代巨噬细胞培养基（DMEM 补充 10% 胎牛血清（FCS，56 °C 热灭活 30 分钟）、1% 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1% L-谷氨酰胺和 10% L929 上清液（由表达巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的 L929 细胞产生的条件培养基））。根据 表 1 设置不同处理组的孔。在用作对照的孔中加入盖玻片（表 1

结果

图 1. 方案 1 的示意图。 感染细胞中含有表达 mCherry 的 Salmonella，其位于完整囊泡或细胞质中，使用洋地黄皂苷进行差异性透化处理。细胞质中的 Salmonella 用与 FITC 偶联的抗 Salmonella 抗体染色。细胞经洗涤后，用 Triton X-100 裂解，用于 FACS 分析。阴性对照细胞在抗体染色前不进行透化处理，而阳性对照细胞则在染色前完全透化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
皂苷素	Sigma	D5628	50 µg/mL
多聚甲醛（PFA）	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
乙酸钾	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A2153
抗沙门氏菌 CSA-1-FITC 抗体	KPL	01-91-99-MG	1/500
抗沙门氏菌 CSA-1 抗体	KPL	02-91-99-MG	1/500
抗钙联蛋白抗体（anti-Calnexin）	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
抗蛋白二硫键异构酶抗体（anti-PDI）	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
皂苷（Saponin）	Sigma	47036
Vectashield 封片剂	Vectorlabs	H-1200
抗兔 IgG 抗体-488	Molecular Probes	A-11070	1/500
庆大霉素（Gentamicin）	Life Technologies	15710-49	100 µg/mL 和 10 µg/mL
吐温 X-100（Triton X-100）	Promega	H5141
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	20012-019
DMEM 培养基	Sigma	D6429
非必需氨基酸（NEAA）	Amimed	5-13K00-H
FACS Fortessa	BD technologies		检测 mCherry，610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		检测 FITC，530 nm