一种定量检测感染性原代巨噬细胞中胞质与液泡内Salmonella的实验方法

摘要

来源：Meunier, E., 等。通过差异性通透化定量分析原代巨噬细胞中胞质与囊泡内沙门氏菌的数量。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种利用差异性通透化方法定量骨髓来源巨噬细胞内胞质和液泡中Salmonella typhimurium的实验方法。巨噬细胞被表达荧光蛋白的Salmonella感染，细菌被内化至一种特化的液泡结构中，称为含Salmonella液泡（SCV）。部分细菌可从SCV中逃逸并进入胞质。利用皂苷（digitonin）处理可选择性通透富含胆固醇的巨噬细胞质膜，而SCV结构保持完整。随后使用荧光标记抗体对胞质内的细菌进行标记，再通过荧光激活细胞分选技术（FACS）定量液泡内和胞质中的细菌比例。

方案

1. 表达mCherry的皂苷素检测 沙门氏菌 （基于FACS的分析）

1. 准备细菌
   注意：本实验使用表达 mCherry 的野生型 Salmonella SL1344（链霉素抗性），该菌株携带编码 mCherry 的质粒（pFPV，mCherry 由 rpsM 启动子驱动表达）。组成型表达 mCherry 不影响细菌的吞噬和增殖能力（数据未显示）。
   1. 感染前一天，在 3 ml LB 培养基中接种菌株，加入链霉素（90 µg/ml）和氨苄青霉素（100 µg/ml，用于 mCherry 表达载体），37 °C 摇床过夜培养。
2. 为感染铺板细胞。
   1. 将野生型 BMDM 以 1.25 × 10⁵ 个细胞/孔的密度接种于 24 孔板中，每孔加入 1 ml 原代巨噬细胞培养基（DMEM 补充 10% 胎牛血清（FCS，56 °C 热灭活 30 分钟）、1% 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1% 非必需氨基酸（NEAA）、1% L-谷氨酰胺和 10% L929 上清液（由表达巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）的 L929 细胞产生的条件培养基））。根据 表 1 设置不同处理组的孔。在用作对照的孔中加入盖玻片（表 1）。
   2. 将细胞在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中过夜孵育。
3. 为感染准备细菌。
   1. 次日，通过将过夜培养物以 1:10 比例稀释于磷酸盐缓冲液（PBS）中，并以仅含 PBS 的对照为空白，测定 OD₆₀₀，从而确定过夜培养物中 Salmonella 的浓度。此操作确保 OD₆₀₀ 处于分光光度计的线性检测范围内。
   2. 计算每毫升 Salmonella 的浓度。OD₆₀₀ 为 1 相当于 1 × 10⁹ 个细菌。
   3. 将细菌用巨噬细胞培养基稀释，使 Salmonella 浓度达到 1.25 × 10⁶ 个细胞/ml。
4. 用 Salmonella 感染细胞。
   1. 移除 BMDM 培养基。向未感染的对照孔（B1–B3，C1–C3）加入 1 ml 巨噬细胞培养基。向 A1–A5 孔加入 1 ml Salmonella 悬液，使感染复数（m.o.i.）为每个细胞 10 个细菌。
   2. 将培养板在 37 °C 下以 300 × g 离心 15 分钟，以同步感染过程。随后将培养板转移至 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中。
5. 使用庆大霉素杀灭细胞外 Salmonella。
   1. 感染后 1 小时，将培养板从培养箱中取出，向每孔加入 0.1 ml 含 0.1 mg/ml 庆大霉素的巨噬细胞培养基，以杀灭细胞外细菌。所有孔（包括未感染对照孔）均需加入庆大霉素，以确保所有细胞处理条件一致。将培养板转移回 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中。
6. 清洗细胞。
   1. 感染后 2 小时，将培养板从培养箱中取出，用 1 ml 预热至 37 °C 的普通 DMEM 洗涤所有孔 2 次，随后更换为含 10 µg/ml 庆大霉素的巨噬细胞培养基（预热至 37 °C），以抑制残留细胞外细菌的生长。将培养板转移至 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中。
7. 配制含去污剂和抗体的新鲜缓冲液。
   1. 在预定分析时间点前，立即用 KHM 缓冲液（110 mM 醋酸钾、20 mM HEPES、2 mM MgCl₂，pH 7.3）配制 1 mg/ml 的皂苷素（digitonin）母液。过滤母液，并用 KHM 缓冲液稀释至工作浓度 50 µg/ml 皂苷素。此外，配制含 0.1% 皂苷（Saponin）的 KHM 缓冲液，以及分别以 1:500 稀释的荧光素异硫氰酸酯标记抗 Salmonella 抗体（CSA-1-FITC）、1:100 稀释的抗钙连蛋白（calnexin）抗体或 1:100 稀释的抗蛋白二硫键异构酶（anti-PDI）抗体，均溶于补充 3% 牛血清白蛋白（BSA）的 KHM 缓冲液中。
8. 细胞通透化处理。
   1. 将培养板从培养箱中取出，用 0.5 ml 预热至 37 °C 的 KHM 缓冲液洗涤 3 次。移除 KHM 缓冲液后，向 A4 孔及 B1/C1 孔加入 0.25 ml 普通 KHM 缓冲液，向 A1–A3 及 B2/C2 孔加入含皂苷素的 KHM 缓冲液，向 A5 及 B3/C3 孔加入含皂苷的 KHM 缓冲液（参见 表 1）。室温孵育恰好 1 分钟，立即用 0.5 ml 预热至 37 °C 的 KHM 缓冲液洗涤 3 次。
9. 一抗染色。
   1. 移除 KHM 缓冲液，向相应孔中加入一抗溶液（山羊抗 Salmonella-FITC，每孔 250 µl，0.1 µg/ml）（参见 图 1、表 1）。将培养板在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中孵育 15 分钟。
   2. 用 1 ml PBS 洗涤细胞 1 次。
10. 感染细胞（A1–A5 孔）：FACS 分析
    1. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，加入 0.5 ml 冰冷 PBS（含 0.1% Triton）。通过带细胞筛网帽的 5 ml FACS 管转移样品，以打散细胞团块。样品保持在冰上。
    2. 进行 FACS 样品分析。利用完全通透化的对照样本，首先根据前向散射和侧向散射（FSC/SSC）设定总细菌的门控，再根据 mCherry 信号（610 nm ± 20 nm 滤光片）进行门控。
    3. 接着，利用完全通透化和未通透化的对照样本，分析总细菌群体中的 FITC 信号，设定细胞质细菌（FITC+，mCherry+）和液泡内细菌（FITC-，mCherry+）的门控（参见 图 2）。
    4. 完成门控设定后，使用 FlowJo 软件按照制造商的操作说明分析样品，确定细胞质细菌与液泡内细菌的百分比。

表1：用于后续沙门氏菌感染、透化及染色的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）在24孔板中的铺板方案。

		通透处理		染色
	玻璃盖玻片	沙门氏菌	皂苷元	皂苷	抗沙门氏菌抗体	抗钙联蛋白抗体	抗蛋白二硫键异构酶抗体
A1（样本）	-/+*	+	+		+
A2（样本）	-/+*	+	+		+
A3（样本）	-/+*	+	+		+
A4（无通透处理对照）	-/+*	+			+
A5（完全通透处理对照）	-/+*	+		+	+
B1（钙联蛋白染色）	+					+
B2（钙联蛋白染色）	+		+			+
B3（钙联蛋白染色）	+			+		+
C1（PDI 染色）	+						+
C2（PDI 染色）	+		+				+
C3（PDI 染色）	+			+			+

结果

图 1. 方案 1 的示意图。 感染细胞中含有表达 mCherry 的 Salmonella，其位于完整囊泡或细胞质中，使用洋地黄皂苷进行差异性透化处理。细胞质中的 Salmonella 用与 FITC 偶联的抗 Salmonella 抗体染色。细胞经洗涤后，用 Triton X-100 裂解，用于 FACS 分析。阴性对照细胞在抗体染色前不进行透化处理，而阳性对照细胞则在染色前完全透化。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
皂苷素	Sigma	D5628	50 µg/mL
多聚甲醛（PFA）	mpbio	219998380
HEPES	Life Technologies	15630
乙酸钾	Sigma	791733
MgCl2	Sigma	M8266
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A2153
抗沙门氏菌 CSA-1-FITC 抗体	KPL	01-91-99-MG	1/500
抗沙门氏菌 CSA-1 抗体	KPL	02-91-99-MG	1/500
抗钙联蛋白抗体（anti-Calnexin）	Enzo Lifesciences	SPA-860D	1/100
抗蛋白二硫键异构酶抗体（anti-PDI）	Enzo Lifesciences	SPA-890	1/100
皂苷（Saponin）	Sigma	47036
Vectashield 封片剂	Vectorlabs	H-1200
抗兔 IgG 抗体-488	Molecular Probes	A-11070	1/500
庆大霉素（Gentamicin）	Life Technologies	15710-49	100 µg/mL 和 10 µg/mL
吐温 X-100（Triton X-100）	Promega	H5141
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	20012-019
DMEM 培养基	Sigma	D6429
非必需氨基酸（NEAA）	Amimed	5-13K00-H
FACS Fortessa	BD technologies		检测 mCherry，610 nm
FACS Fortessa	BD technologies		检测 FITC，530 nm