一种通过浊度分析法监测经预处理人血小板胶原诱导聚集的方法

摘要

来源：Molica, F. 等，人洗涤血小板中的浊度测定：Pannexin1抑制剂亮蓝FCF对胶原诱导聚集的影响。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了通过浊度分析法评估经预处理的洗涤人血小板中胶原诱导的血小板聚集。对照孔显示胶原诱导的聚集现象，而高浓度抑制剂可阻断Pannexin-1通道，从而抑制胶原诱导的血小板聚集，表现为浊度无明显变化。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 人血采集与洗涤血小板分离的缓冲液制备

1. 通过将1.4 g柠檬酸一水合物（C₆H₈O₇•H₂O，66.6 mM），2.5 g 二水合柠檬酸三钠（Na₃C₆H₅O₇•2 H₂O，85 mM）和 2 g 无水 D(+)-葡萄糖。该溶液的 pH 值约为 4.5。
2. 按如下方法配制台氏液缓冲液的储备溶液
   1. 通过溶解80 g氯化钠（NaCl）、2 g氯化钾（KCl）、10 g碳酸氢钠（NaHCO₃）和1.5 g磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）于800 mL去离子水中，配制储备液1。₃）和0.58 g一水合磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）₂PO₄H*₂O) 在 500 mL 蒸馏 H₂O。各成分的最终浓度分别为 2.73 M、53.6 mM、238 mM 和 8.4 mM。将溶液置于 4 °C 保存。
   2. 通过将10.15 g六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O）溶于水中，配制储备液2₂*6 H₂O)（100 mM）溶于500 mL蒸馏水（H₂O）。将溶液保存在 4 °C。
   3. 通过将10.95 g（100 mM）六水合氯化钙CaCl₂·6H₂O溶于水中，配制储备液3₂*6 H₂O，加入500 mL蒸馏H₂O. 将溶液置于 4 °C 保存。
3. 通过将2.5 mL储存液1用蒸馏水定容至50 mL，配制Tyrode缓冲液₂O。这相当于终浓度为 136.5 mM NaCl、2.68 mM KCl、11.9 mM NaHCO₃₃，以及 0.42 mM NaH₂PO₄H*₂O. 调节pH至7.35，用0.22 μm滤器过滤除菌。
4. 通过将5 mL储存液1、1 mL储存液2、2 mL储存液3、0.5 mL 1 M HEPES、1.8 mL 200 g/L人血清白蛋白和0.1 g无水D(+)-葡萄糖溶于蒸馏水，定容至100 mL，配制0.35%白蛋白Tyrode缓冲液（TA缓冲液）。₂O.
   1. 用1N盐酸（HCl）将pH值调节至7.35，并通过添加蒸馏水将渗透压调至295 mOsm/L。₂O（总体积的10%）。该溶液中各成分的终浓度为：124 mM NaCl、2.44 mM KCl、10.82 mM NaHCO₃₃，0.38 mM NaH₂PO₄H*₂O，0.91 mM MgCl₂*6 H₂O，1.82 mM CaCl₂*6 H₂O. 整个实验过程中将TA缓冲液保持在37 °C。

2. 血液采集

1. 使用19 G针头和无或低张力止血带，从肘前静脉采集45-50 mL静脉血，收集至含有ACD抗凝剂的50 mL试管中（每6份血液加入1份ACD）。弃去最初1-2 mL血液，以避免凝血酶和组织因子的存在。
   1. 采集后，通过轻轻倒置试管将血液与ACD混合。将样本在37 °C孵育10分钟。

3. 人洗涤血小板的制备

1. 将离心机预热至 37 °C。以下所有离心步骤均在此温度下进行。
2. 将采集的血液分装至 15 mL 离心管中（每管 5 mL），在 250 × g 条件下离心 13 分钟，以获得富血小板血浆（PRP）。
   注意：此离心步骤将在样本中形成三层：1）上层，由血浆、血小板及少量白细胞组成；2）中间层，富含白细胞；3）底层，主要由红细胞构成。
3. 用移液器小心吸取上层液体转移至新的 15 mL 离心管中，以最大程度避免红细胞和白细胞污染，并在 37 °C 下孵育 10 分钟。
4. 将 PRP 在 2,200 × g 条件下离心 12 分钟（适用于 5 mL PRP）。
   注意：此离心步骤应使用低刹车或无刹车模式。
5. 弃去上清液（即乏血小板血浆），用塑料巴斯德移液管将沉淀物小心重悬于 10 mL 含有肝素（5,000 U/mL）2 µL/mL 和 25 μM 前列环素（PGI₂）2.5 µL/mL 的 TA 缓冲液中。在 37 °C 下孵育 10 分钟。
6. 加入 2.5 µL/mL 的 25 μM 前列环素-I2（PGI₂），并在 1,900 × g 条件下离心 8 分钟（使用低刹车或无刹车模式）。
7. 弃去上清液，用含有 2.5 µL/mL 的 25 μM PGI₂ 的 5 mL TA 缓冲液，通过塑料巴斯德移液管小心重悬沉淀物。在 37 °C 下孵育 10 分钟。
8. 在孵育期间，取 150 µL 血小板悬液转移至 1.5 mL 离心管中，使用自动细胞计数仪（通过测量直流电阻变化来检测血细胞大小）进行血小板计数。
9. 孵育 10 分钟后，向血小板悬液中加入 2.5 µL/mL 的 25 μM PGI₂，并立即在 1,900 × g 条件下离心 8 分钟。
10. 弃去上清液，用适量含有 0.01 U/mL 酶解腺苷三磷酸双磷酸酶（apyrase）（终浓度为 0.32 U/mL）的 TA 缓冲液将沉淀物重悬至浓度为 250,000 个血小板/µL（即若细胞计数为每 µL 500,000 个，则用 10 mL TA 缓冲液重悬）。
    注意：使用高浓度 apyrase 是为了避免在无激动剂存在时，由于腺苷三磷酸（ATP）的自发释放导致 P2X 嘌呤受体 1（P2X1 受体）发生脱敏。这一点非常重要，因为胶原诱导的反应依赖于活化血小板释放的 ATP 对 P2X1 受体的快速旁分泌/自分泌激活。如果血小板信号通路不严格依赖 P2X1 功能的维持，则可使用 0.02 U/mL 的 apyrase。已有多个研究表明，0.02 U/mL 的 apyrase 可防止二磷酸腺苷（ADP）受体 P2Y 嘌呤受体 1（P2Y1）脱敏，同时对 P2X1 反应的影响可忽略不计。
11. 在进行聚集测定前，将细胞悬液在 37 °C 下孵育至少 30 分钟。制备好的样品在 5 至 8 小时内保持稳定。

4. 聚集测定法

1. 在Tyrode缓冲液中配制纤维蛋白原（56 mg/mL）。
2. 将260 µL血小板悬液移液至玻璃比色皿中（图1A；左侧比色皿）中加入10 µL纤维蛋白原（56 mg/mL）和一根磁力搅拌棒，然后将悬浮液置于聚集仪的孵育孔中，在37 °C孵育2–3分钟图1B 和 1C).
3. 用Panx1抑制剂亮蓝FCF预孵育，分别加入10 µL的2.8 mM或28 mM储备液（终浓度分别为100 μM和1 mM），在37 °C孵育7分钟。
4. 使用不含血小板的TA缓冲液，加入10 µL纤维蛋白原（56 mg/mL）和10 µL亮蓝FCF（2.8 mM或28 mM），通过测定该比色皿的光密度（OD），将聚集仪校准至假定的100%聚集值。
   1. 将比色皿放入聚集反应孔中，在自动搅拌条件下，按下与聚集仪相连的计算机键盘上对应的按钮即 如果使用聚集孔1，请按F1。
      注意： 以下实验涉及食用亮蓝FCF。用于校准的化合物需根据实验条件进行调整。
5. 使用将用于实验的相同血小板样本，在自动搅拌条件下对聚集仪进行校准，设定其假定的0%聚集值。
   1. 将比色皿放入聚集反应孔中，按下连接聚集仪的计算机键盘上对应的按钮。等待约20-30秒后再进行下一步操作。此延迟步骤旨在确保在加入激动剂前不会发生聚集反应。
      注意： 由于血小板数量的任何差异都可能影响测得的OD值，因此每次单独测量时都需要重复0%校准步骤。
6. 向比色杯中加入20 µL所需激动剂，例如15 µg/mL胶原蛋白（终浓度1 µg/mL）或1.125 mM花生四烯酸（终浓度75 µM）。立即按下连接至聚集仪的计算机键盘上的相应按钮，启动记录，并开始持续自动搅拌。
   注意： 激动剂的加入可诱导血小板活化。实验结束时，可在玻璃比色皿中清晰观察到血小板聚集体。图1A；右侧比色皿）。
7. 6 分钟后录制将自动停止。此时，单击计算机上的保存图标以保存数据。
   注意： 聚集速率的计算由计算机完成，计算机将聚集过程的最终结果以百分比形式表示。

结果

图1：聚集仪检测。（A）用于血小板聚集检测的玻璃比色皿（内含搅拌磁子）的代表性图像。左侧比色皿显示静息状态的血小板，右侧比色皿显示经胶原诱导激活后的血小板聚集体。（B）用于比浊法测量的8通道聚集仪的代表性图像。用于孵育血小板悬液的孔（星号标记）在37 °C条件下使用玻璃比色皿，而用于测量的孔（白色箭头指示）在图C中注明。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
柠檬酸一水合物（C6H8O7*H2O）	Roth	5949-29-1	对眼睛有损害/刺激危险
柠檬酸三钠二水合物（Na3C6H5O7*2H2O）	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	-
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S9888	-
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9541	-
碳酸氢钠（NaHCO3）	Sigma-Aldrich	S6014	-
磷酸二氢钠一水合物（NaH2PO4*H2O）	Sigma-Aldrich	S9638	-
六水合氯化镁（MgCl2*6H2O）	Sigma-Aldrich	M9272	-
六水合氯化钙（CaCl2*6H2O）	Sigma-Aldrich	442909	对眼睛有损害/刺激危险
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（Hepes）	ThermoFisher Scientific	15630	-
人血清白蛋白	CSL Behring	00257/374	-
盐酸	Sigma-Aldrich	320331	对呼吸系统具有腐蚀性和刺激性。可导致严重的皮肤和眼睛损伤。
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
肝素	Drosspharm AG/SA	20810
前列环素 I2（PGI2）	Cayman	18220	-
土豆来源的腺苷酸磷酸化酶（Apyrase）	Sigma-Aldrich	A6535	-
纤维蛋白原（Haemocomplettan）	CSL Behring	HS 73466011	-
血小板聚集仪 SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
亮蓝FCF（赤藓蓝二钠盐）	Sigma-Aldrich	80717	对水生生物有害且具有长期持续影响（避免释放至环境）
胶原蛋白	Horm, Nycomed		-
花生四烯酸	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
血细胞计数仪 Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
玻璃比色皿	SD-Innovation	THCV1000	-
磁力搅拌器	SD-Innovation	THA100	-