一种通过浊度分析法监测经预处理人血小板胶原诱导聚集的方法

摘要

来源：Molica, F. 等，人洗涤血小板中的浊度测定：Pannexin1抑制剂亮蓝FCF对胶原诱导聚集的影响。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了通过浊度分析法评估经预处理的洗涤人血小板中胶原诱导的血小板聚集。对照孔显示胶原诱导的聚集现象，而高浓度抑制剂可阻断Pannexin-1通道，从而抑制胶原诱导的血小板聚集，表现为浊度无明显变化。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 人血采集与洗涤血小板分离的缓冲液制备

1. 通过将1.4 g柠檬酸一水合物（C₆H₈O₇•H₂O，66.6 mM），2.5 g 二水合柠檬酸三钠（Na₃C₆H₅O₇•2 H₂O，85 mM）和 2 g 无水 D(+)-葡萄糖。该溶液的 pH 值约为 4.5。
2. 按如下方法配制台氏液缓冲液的储备溶液
   1. 通过溶解80 g氯化钠（NaCl）、2 g氯化钾（KCl）、10 g碳酸氢钠（NaHCO₃）和1.5 g磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）于800 mL去离子水中，配制储备液1。₃）和0.58 g一水合磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·H₂O）₂PO₄H*₂O) 在 500 mL 蒸馏 H₂O。各成分的最终浓度分别为 2.73 M、53.6 mM、238 mM 和 8.4 mM。将溶液置于 4 °C 保存。
   2. 通过将10.15 g六水合氯化镁（MgCl₂·6H₂O）溶于水中....

结果

图1：聚集仪检测。（A）用于血小板聚集检测的玻璃比色皿（内含搅拌磁子）的代表性图像。左侧比色皿显示静息状态的血小板，右侧比色皿显示经胶原诱导激活后的血小板聚集体。（B）用于比浊法测量的8通道聚集仪的代表性图像。用于孵育血小板悬液的孔（星号标记）在37 °C条件下使用玻璃比色皿，而用于测量的孔（白色箭头指示）在图C中注明。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
柠檬酸一水合物（C6H8O7*H2O）	Roth	5949-29-1	对眼睛有损害/刺激危险
柠檬酸三钠二水合物（Na3C6H5O7*2H2O）	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	-
氯化钠（NaCl）	Sigma-Aldrich	S9888	-
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9541	-
碳酸氢钠（NaHCO3）	Sigma-Aldrich	S6014	-
磷酸二氢钠一水合物（NaH2PO4*H2O）	Sigma-Aldrich	S9638	-
六水合氯化镁（MgCl2*6H2O）	Sigma-Aldrich	M9272	-
六水合氯化钙（CaCl2*6H2O）	Sigma-Aldrich	442909	对眼睛有损害/刺激危险
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（Hepes）	ThermoFisher Scientific	15630	-
人血清白蛋白	CSL Behring	00257/374	-
盐酸	Sigma-Aldrich	320331	对呼吸系统具有腐蚀性和刺激性。可导致严重的皮肤和眼睛损伤。
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
肝素	Drosspharm AG/SA	20810
前列环素 I2（PGI2）	Cayman	18220	-
土豆来源的腺苷酸磷酸化酶（Apyrase）	Sigma-Aldrich	A6535	-
纤维蛋白原（Haemocomplettan）	CSL Behring	HS 73466011	-
血小板聚集仪 SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
亮蓝FCF（赤藓蓝二钠盐）	Sigma-Aldrich	80717	对水生生物有害且具有长期持续影响（避免释放至环境）
胶原蛋白	Horm, Nycomed		-
花生四烯酸	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
血细胞计数仪 Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
玻璃比色皿	SD-Innovation	THCV1000	-
磁力搅拌器	SD-Innovation	THA100	-