一种用于鉴定CXCR4相互作用剂的细胞检测方法

摘要

来源：Claes, S. 等，一种基于动力学荧光的 Ca²⁺ 流动检测法，用于鉴定 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗剂及别构调节剂 J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种涉及表达CXCR4趋化因子受体的胶质母细胞瘤细胞的细胞检测方法。该检测利用钙敏感性染料，在试剂作用时测量荧光变化，从而揭示细胞信号转导动态。

方案

注意： 第1和第2节所述的所有步骤均须在层流柜内的无菌条件下进行。

1. U87.CD4.hCXCR4 细胞的维持

1. 在37°C、5% CO₂条件下，将细胞置于T75培养瓶中培养₂ 在湿润的培养箱中。
   注意： 这 体外 本方案中使用的细胞系是一种稳定表达分化簇4（CD4）和人CXC趋化因子受体4（CXCR4）的U87胶质母细胞瘤细胞系，此前已有描述。通过流式细胞术持续监测CD4和CXCR4的细胞表面表达，其表达水平随时间保持稳定（约100% CD4阳性）⁺ 和约 100% CXCR4⁺ 细胞）。本方案不涉及所用细胞系的建立及通过流式细胞术检测受体表达水平的详细步骤。
   1. 在细胞融合度达到80-85%时进行传代培养。所有试剂在用于细胞培养前应恢复至室温（RT）。
   2. 从细胞中移除培养过的培养基，用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）清洗细胞单层一次。
   3. 加入3 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 四乙酸（胰蛋白酶-EDTA），并均匀覆盖于细胞单层表面。随后吸去多余的胰蛋白酶-EDTA，于37 °C孵育最多5分钟，直至细胞开始脱落。
   4. 加入10 mL新鲜的完全培养基（DMEM + 10%胎牛血清（FBS）+ 0.01 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）+ 适量筛选剂）。轻轻吹打重悬细胞。将细胞悬液转移至无菌的50 mL离心管中。
   5. 使用选择的方法对活细胞数量进行计数。对于U87胶质母细胞瘤细胞，其存活率通常可达约100%。
      注意： 细胞数量可以通过多种方法测定。我们通常使用基于台盼蓝染色的自动细胞分析系统（参见 材料表）根据其标准操作流程进行处理，但其他方法同样可行。
   6. 加入 2 x 10⁶ 或 3 × 10⁶ 将（活细胞）加入至T75培养瓶中，使终体积为25 mL新鲜培养基，于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下培养₂).
      注意： 如果 3 x 10⁶ 细胞将用于实验，2天后细胞融合度可达80-90%。如果2 x 10⁶ 若使用其他细胞系，应首先通过实验确定细胞的生长速率，因为不同细胞系在3天后将达到相同的汇合度。

2. 钙离子（Ca²⁺ ）动员实验的细胞接种

1. 在细胞传代当天（第0天），用0.1%明胶溶液包被黑色壁、透明底的聚苯乙烯96孔板（见 材料表），以促进细胞贴壁。 
   注意：若使用市售的预包被板（见 材料表），则可省略96孔板的明胶包被步骤。建议在继续本实验方案前，先评估所研究的每种细胞系是否可使用预包被板替代人工包被。
   1. 通过将1 g明胶加入100 mL PBS中配制1%明胶溶液。使用前用PBS稀释10倍。为提高明胶溶解度，可将溶液加热至37 °C。
   2. 使用多通道移液器向96孔板每孔加入100 µL 0.1%明胶溶液，在室温下孵育2小时。
2. 在此期间，准备将细胞接种至已包被的96孔板中。
   1. 从培养瓶中消化细胞，重悬于新鲜培养基中，并使用台盼蓝染色法进行细胞计数。
   2. 将细胞在50 mL离心管中以400 × g离心5分钟，室温操作。
   3. 用新鲜培养基（DMEM + 10% FBS + 1% HEPES，不含抗生素）重悬细胞，使细胞密度达到0.1 × 10⁶ （活细胞）/mL。
3. 将黑色壁透明底板倒置，用纸巾吸干明胶溶液，随后每孔加入200 µL PBS以去除残留明胶，再次倒置平板。
4. 向明胶包被的96孔板每孔加入200 µL细胞悬液（相当于0.2 × 10⁵ 个细胞）（此后该板将称为“测量板”）。
5. 将板置于37 °C、5%二氧化碳（CO₂）条件下过夜培养。

3. 使用荧光 Ca²⁺ -敏感染料对细胞进行负载

1. 第1天进行实际的Ca²⁺ 动员实验，首先将已接种的细胞加载荧光Ca²⁺结合染料fluo-2乙酰甲酯（fluo-2 AM）。
   1. 通过向200 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS，10倍浓度，不含酚红，不含碳酸氢钠）中加入40 mL HEPES（1 M），然后加超纯水至终体积为2 L，并加入4 g牛血清白蛋白（BSA）。通过磁力搅拌溶解BSA。用氢氧化钠（NaOH）调节pH至7.4，并过滤溶液。
      注意：在后续所有步骤中均使用该缓冲液，称为“实验缓冲液”。
   2. 制备荧光Ca²⁺敏感性染料fluo-2 AM的储存液（4 mM，溶于二甲基亚砜（DMSO）中）。避免长时间暴露于光照下。将1 mg fluo-2 AM（分子量：1,061 g/mol）溶于235.6 µL DMSO中。
   3. 制备fluo-2 AM的工作液。对于一块96孔板，取12.5 µL fluo-2 AM储存液（4 mM）与12.5 µL非离子型聚醇表面活性剂（例如，Pluronic F-127）溶液（20% 质量/体积，溶于DMSO中，参见 材料表）混合。将22 µL该混合液加入11 mL实验缓冲液中，置于15 mL离心管内。fluo-2 AM的终浓度为4 µM。 
      注意：非离子型表面活性剂作为分散剂，用于提高fluo-2 AM在水相中的溶解度，从而增强细胞摄取效果。为使表面活性剂溶于DMSO，需将样品在37 °C加热，并定期混匀，以获得均一溶液。
   4. 将测量用96孔板中先前接种的细胞培养液弃去，方法为将整块板倒置后在纸巾上轻轻吸干。
   5. 使用多通道移液器向每孔加入100 µL染料加载溶液，在室温避光条件下孵育45分钟。

4. 含趋化因子配体CXC趋化因子配体12（CXCL12）或待研究化合物的96孔聚丙烯板的制备

1. 获取圆底聚丙烯（PP）96孔板（参见 材料表).
   1. 将CXCL12储备液（1 mg/mL）和待测化合物的储备液在室温下平衡。    
      注意： CXCL12 储存液用超纯水配制，其中添加 0.01% Tween20，分装为单次使用 aliquot 后于 -20 °C 保存。
   2. 在检测缓冲液中配制5倍浓缩的CXCL12溶液（250 ng/mL，相当于31.25 nM）以及每种化合物的5倍浓缩稀释液（用检测缓冲液稀释）。
   3. 根据预设的孔板布局，将储备液分别加入相应的96孔板中。在含有CXCL12的孔板（“趋化因子板”）中，每孔加入75 µL；在含有化合物的孔板（“化合物板”）中，每孔加入50 µL。
      注意： 两种化合物和CXCL12在分配至检测板后最终均被稀释5倍。在化合物板和趋化因子板中，均需设置仅含检测缓冲液的阴性对照孔。同时，还需设置阳性对照孔（即，趋化因子孔板中含有CXCL12的孔，而在化合物孔板的对应孔中则含有测定缓冲液）。

5. 荧光酶标仪的实验方案设置

注意：本实验方案中使用的荧光酶标仪详见 材料表。

1. 首先打开荧光酶标仪冷却装置的电源，然后开启荧光酶标仪本身。等待数分钟使其启动，并打开系统的软件。
2. 使用拖放式菜单创建检测方案，包含以下步骤：
   1. 在“设置”框中，选择“读取模式”（Read_Mode），激发波长：470–495 nM；发射波长：515–575 nM。
      注意：所选波长适用于Ca²⁺敏感性染料fluo2。
   2. 添加“与TF混合”（Mix with TF，转移液体）框，用于自动混合化合物板中的化合物，该板将放置在仪器的源2位置（见步骤6.4）。选择每个孔中15 µL溶液进行自动吸液并混合三次。将移液吸头高度调整至液面以下20 µL处。设定吸液和分配速度为50 µL/s。
      注意：移液吸头高度指的是吸头下方剩余液体的体积。例如，若化合物板的孔中含有50 µL液体，则30 µL高度对应于液面以下20 µL。化合物溶液的取液体积、混合速度、混合过程中吸头的位置以及混合循环次数均可通过软件进行调整。
   3. 在“转移液体”框中，定义将从化合物板的每个孔转移20 µL至检测板。在吸液过程中，将移液吸头置于液面以下20 µL处 即，吸液时高度设为30 µL，向检测板分配时高度设为60 µL。设定吸液速度为50 µL/s，分配速度为25 µL/s。
      注意：化合物板每孔含有50 µL溶液（见步骤4.1.3），因此30 µL高度对应于液面以下20 µL。检测板每孔将含有80 µL检测缓冲液（见步骤6.3），因此60 µL高度对应于吸头类似的位置。
   4. 选择“与TF读取”（Read with TF）按钮。在第一个区间内，选择60次读数（荧光测量），读数间隔时间为1秒。定义在向检测板分配化合物前记录10次读数，之后记录50次读数。第二个区间设定读数间隔时间为30秒，共18次读数。 
      注意：在此步骤中，荧光将进行动力学测量（按定义的时间间隔），总时长约10分钟。
   5. 在方案中添加“清洗吸头”（Wash Tips）按钮三次。在每次清洗步骤中，选择清洗液类型：液体A（超纯水）或液体B（70%乙醇），清洗循环次数（1次），泵速（快速），以及每次清洗过程中的冲程次数（5次）。
      注意：第一次和最后一次清洗使用液体A，第二次清洗使用液体B。
   6. 添加“暂停移液器”（Pause Pipettor）功能。将移液器设定为暂停300秒。
      注意：在方案中加入此步骤后，集成在荧光酶标仪设备中的移液器头将在继续执行方案前暂停5分钟。
   7. 添加“与TF混合”框，以实现对趋化因子板中CXCL12溶液的自动混合，该板将放置在仪器的源3位置（见步骤6.4）。选择每个孔中15 µL溶液进行自动吸液并混合三次。在吸液和混合过程中，将移液吸头置于液面以下20 µL处。吸液和分配速度设定为50 µL/s。
      注意：与步骤5.2.2类似，这些参数可进行调整。
   8. 在随后的“转移液体”框中，定义从趋化因子板的每个孔转移25 µL至检测板。将吸头置于液面以下20 µL处 即，从每孔含75 µL的趋化因子板吸液时高度为55 µL（见步骤4.1.3），向检测板分配时高度为80 µL。设定吸液速度为50 µL/s，分配速度为25 µL/s。
   9. 添加“与TF读取”按钮。在第一个区间内，选择145次读数，读数间隔时间为1秒。定义在向检测板分配CXCL12前记录5次读数，之后记录140次读数。第二个区间设定读数间隔时间为6秒，共20次读数。
      注意：总体而言，在整个方案中共记录243次读数（荧光测量）：步骤5.2.4中78次，步骤5.2.9中165次。
   10. 与步骤5.2.5类似，在方案中添加“清洗吸头”按钮三次。
       注意：在方案末尾加入此步骤，可使吸头在无需更换的情况下重复用于其他检测。
3. 点击“设定载台温度”（Set stage temperature）按钮，并选择37 °C，将设备温度设定为37 °C。

6. 运行荧光检测

1. 测量板与加样缓冲液孵育45分钟后（见步骤3.1.5），将板翻转倒掉缓冲液，并在纸巾上干燥。
2. 每孔加入150 µL检测缓冲液洗涤接种的细胞，孵育2分钟。
3. 再次将板翻转倒掉缓冲液，使用多通道移液器每孔加入80 µL检测缓冲液。
4. 将所有板放入设备的相应位置：化合物板置于源2位置，趋化因子板置于源3位置，测量板置于读数位置。在源1加样头位置放置一盒黑色加样头。关闭设备门，孵育5分钟后再继续后续操作。
5. 点击“Protocol signal test”按钮，以确定板上的背景相对光单位（RLUs）和荧光变异情况。此时将弹出一个新窗口，选择“Test signal”。
   注意：在此步骤中，背景RLUs由集成在荧光读板仪光学部件中的增强型电荷耦合器件 （ICCD）相机测定。这些RLUs来源于发光二极管（LEDs）（LED输出波长470–495 nm）对Ca²⁺敏感染料（fluo-2）的激发。8,000–10,000 RLUs的数值适用于本实验。如有必要，可通过调整激发强度（选择Exc. Intensity）或相机门控时间（选择Gate Open）来调节RLUs。板内变异应理想地低于7.5%。
6. 若获得8,000–10,000 RLUs的背景值，则点击“Update”。点击保存按钮以保存主程序。
   注意：此操作会将信号测试程序中的设置继承至主程序中。
7. 按下“RUN”按钮开始运行检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fluo-2 AM	Abcam	ab142775	荧光性 Ca²⁺ 敏感染料
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G	普流罗尼克酸
明胶	Sigma	G9391
AMD3100	Sigma	A5602-5 mg	特异性 CXCR4 拮抗剂
马拉维若	AnorMed 公司惠赠		抗逆转录病毒药物，CCR5 拮抗剂
趋化因子配体 CXCL12	PeproTech	300-28A
趋化因子配体 CCL5	PeproTech	300-06
胎牛血清（FBS）	Gibco (Life Technologies)	10270-106
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A1933-25G
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco (Life Technologies)	41965-039
HBSS（10 倍浓度），含钙、含镁，不含酚红	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES（1 M）	Gibco (Life Technologies)	15630-056
胰蛋白酶-EDTA（0.25 %），含酚红	Gibco (Life Technologies)	25200-056
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Falcon 管，50 mL	Greiner Bio-One	227 261
组织培养瓶（T75）	Corning	353024
黑色 96 孔板，透明平底，带盖	Costar/Fisher Scientific	10530753	用于细胞接种的检测板（96 孔）
聚丙烯（PP）板	Thermo Scientific (VWR)	732-2661	用于制备化合物板和趋化因子板的圆底板
FLIPR Tetra 高通量细胞筛选系统	Molecular Devices		集成移液头和 ICCD 相机的荧光酶标仪
FLIPR Tetra LED 模块 470 - 495 nm	Molecular Devices	0200-6128	用于激发荧光性 Ca²⁺ 敏感染料的发光二极管
FLIPR Tetra 发射滤光片 515 - 575 nm	Molecular Devices	0200-6203	与荧光染料兼容的发射滤光片
FLIPR Tetra 96 头	Molecular Devices	0310-4536	集成于荧光酶标仪中的 96 孔移液头
ScreenWorks	Molecular Devices		用于 FLIPR Tetra 数据分析和可视化的软件包
Vi-CELL	Beckman Coulter		细胞活力分析仪
Corning CellBIND 96 孔平底透明黑色聚苯乙烯微孔板，带盖，无菌	Corning	3340	预包被的 96 孔检测板，可作为检测板手动包被的替代方案。