体外测定α-半乳糖苷酶A和酸性α-葡萄糖苷酶活性

摘要

来源：Lukas, J., 等 体外 用于检测法布里病和庞贝病中药物伴侣反应性的酶活性测定 J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了 体外 使用合成的4-甲基伞形基底物测定样品中α-半乳糖苷酶A和酸性α-葡萄糖苷酶的酶活性。

方案

1. 细胞收获及α-半乳糖苷酶A或酸性α-葡萄糖苷酶活性测定

1. 细胞收获​
   1. 在收获当天，将细胞从培养箱中取出，吸除培养基。用含 Ca₂+ 和 Mg₂+ 的 PBS 小心洗涤细胞 2 次。
      注意：此步骤至关重要，因为 DGJ 和 DNJ 分别是 α-半乳糖苷酶和 α-葡萄糖苷酶的强效抑制剂，任何残留都会使检测结果无效。
   2. 直接向细胞表面加入 200 µL 去离子水。将细胞从培养板上冲洗下来，并转移至 1.5 mL 反应管中。

2. 通过冻融法进行匀浆处理

1. 将样品放入合适的泡沫架中，涡旋振荡5秒以提高裂解效率。将样品交替置于液氮中10秒，然后放入室温水浴中直至完全解冻（约5分钟）。
2. 重复此步骤5次，然后在10,000 × g离心5分钟。保留上清液，并用移液器转移至新的反应管中。

3. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度

1. 为每个样品准备一个新离心管，每管中加入40 µL去离子H₂

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Merck, Darmstadt, Germany	1,06,40,41,000
氯化钾	Merck, Darmstadt, Germany	1,04,93,60,500
MgCl2 x 6H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1,05,83,30,250
一水合D(+)-葡萄糖	Merck, Darmstadt, Germany	1,08,34,22,500
氢氧化钠	Merck, Darmstadt, Germany	1,06,49,80,500
乙酸钠	Merck, Darmstadt, Germany	1,06,26,40,050
HEK293H细胞系	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	11631-017
SafeSeal反应管，1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72,706
Tecan GENios读板仪	Tecan, Männedorf, Switzerland
Magellan数据分析软件v6.6	Tecan, Männedorf, Switzerland	N.A