体外测定α-半乳糖苷酶A和酸性α-葡萄糖苷酶活性

摘要

来源：Lukas, J., 等 体外 用于检测法布里病和庞贝病中药物伴侣反应性的酶活性测定 J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了 体外 使用合成的4-甲基伞形基底物测定样品中α-半乳糖苷酶A和酸性α-葡萄糖苷酶的酶活性。

方案

1. 细胞收获及α-半乳糖苷酶A或酸性α-葡萄糖苷酶活性测定

1. 细胞收获​
   1. 在收获当天，将细胞从培养箱中取出，吸除培养基。用含 Ca₂+ 和 Mg₂+ 的 PBS 小心洗涤细胞 2 次。
      注意：此步骤至关重要，因为 DGJ 和 DNJ 分别是 α-半乳糖苷酶和 α-葡萄糖苷酶的强效抑制剂，任何残留都会使检测结果无效。
   2. 直接向细胞表面加入 200 µL 去离子水。将细胞从培养板上冲洗下来，并转移至 1.5 mL 反应管中。

2. 通过冻融法进行匀浆处理

1. 将样品放入合适的泡沫架中，涡旋振荡5秒以提高裂解效率。将样品交替置于液氮中10秒，然后放入室温水浴中直至完全解冻（约5分钟）。
2. 重复此步骤5次，然后在10,000 × g离心5分钟。保留上清液，并用移液器转移至新的反应管中。

3. 使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度

1. 为每个样品准备一个新离心管，每管中加入40 µL去离子H₂O，并加入10 µL样品。短暂涡旋混匀后，取10 µL转移至96孔板的一个孔中（每个样品设三个复孔）。用去离子H₂O稀释2 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）储备液，配制标准曲线：50 µL H₂O/50 µL BSA；60 µL H₂O/40 µL BSA；70 µL H₂O/30 µL BSA；80 µL H₂O/20 µL BSA；90 µL H₂O/10 µL BSA；100 µL H₂O。
2. 加入200 µL BCA试剂（试剂A与试剂B按50:1比例混合）启动反应，在37 °C避光条件下于轨道摇床上轻微振荡（300 rpm）孵育1小时。使用酶标仪在560 nm处测定吸光度。
   注意：样品中蛋白质浓度通常为每µL含1至1.5 µg。

4. 使用人工4-甲基伞形基底物（4-MUG）测定酶活性

1. 将每份样品按计算量稀释后，用移液器转移至新的1.5 mL离心管中，制备成含0.05（α-半乳糖苷酶A）或0.5（酸性α-葡萄糖苷酶）µg蛋白/µL的溶液。再次涡旋振荡样品5秒，然后取10 µL该稀释液加入96孔板中（每个样品设两个复孔）。
2. 通过加入20 µL相应的底物溶液启动反应：
   对于α-半乳糖苷酶A：0.06 M磷酸柠檬酸缓冲液（pH 4.7）中含2 mM 4-甲基伞形基-α-D-吡喃半乳糖苷（4-MU-gal）。
   酸性α-葡萄糖苷酶反应液：0.025 M醋酸钠缓冲液（pH 4.0）中含2 mM 4-甲基伞形基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-MU-glu）
3. 在37 °C、避光条件下，于旋转摇床（300 rpm）上轻微振荡孵育酶反应1小时。加入200 µL经调节至pH 10.5的1.0 M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，终止反应。
4. 从0.01 mg/mL的4-甲基伞形酮（4-MU）储备液制备标准曲线，步骤如下：
   100 µL H2O/不含4-MU；80 µL H2O/20 µL 4-MU；60 µL H₂O/ 40 µL 4-MU；40 µL H₂O/ 60 µL 4-MU；20 µL H₂O/ 80 µL 4-MU；无H₂每100 µL 4-MU中，取各稀释液10 µL加入96孔板中（设复孔），每孔加入200 µL 1.0 M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，以调整体积和pH。
5. 使用配备适当滤光片组的荧光读板仪检测酶活性，并采用与该荧光读板仪配套的软件分析数据。
   注意： 两种4-MUG底物在α-半乳糖苷酶A或酸性α-葡萄糖苷酶作用下均被降解为4-MU。释放出的4-MU是一种荧光染料，可使用微孔板荧光读板仪在激发波长360 nm和发射波长465 nm条件下进行检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Merck, Darmstadt, Germany	1,06,40,41,000
氯化钾	Merck, Darmstadt, Germany	1,04,93,60,500
MgCl2 x 6H2O	Merck, Darmstadt, Germany	1,05,83,30,250
一水合D(+)-葡萄糖	Merck, Darmstadt, Germany	1,08,34,22,500
氢氧化钠	Merck, Darmstadt, Germany	1,06,49,80,500
乙酸钠	Merck, Darmstadt, Germany	1,06,26,40,050
HEK293H细胞系	Invitrogen, Karlsruhe, Germany	11631-017
SafeSeal反应管，1.5 mL	Sarstedt, Nümbrecht, Germany	72,706
Tecan GENios读板仪	Tecan, Männedorf, Switzerland
Magellan数据分析软件v6.6	Tecan, Männedorf, Switzerland	N.A