通过病毒灭活实验评估抗病毒测试化合物的有效性

摘要

来源：Tai, C. 等，用于抗病毒化合物鉴定与评价的早期病毒进入检测方法。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了病毒灭活实验，演示了抗病毒药物对病毒颗粒作用效果的评估过程。

方案

1. 病毒灭活实验

注：不同病毒的孵育时间与病毒剂量示例见图1A。通过提高MOI/PFU值，也可测试更高浓度的病毒。

1. 将Huh-7.5细胞接种于96孔板中（1 × 10⁴ 每孔细胞数）并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育₂ 过夜培养以获得单层细胞。
2. 将待测化合物或对照物（终浓度分别为：CHLA = 50 μM；PUG = 50 μM；肝素 = 1,000 μg/ml；DMSO = 1%）与HCV病毒颗粒在37 °C下共同孵育图1A，'Long-Term'）按1:1比例混合。例如，向含有1 × 10⁴ FFU的100 μl病毒接种液中加入100 μl浓度为100 μM的CHLA工作稀释液，最终CHLA处理浓度为50 μM。
3. 将病毒-药物混合物稀释至测试化合物的“亚治疗浓度”（无效浓度）。例如，CHLA 和 PUG 对 HCV 的无效浓度为 1 μM³¹；因此，需要对该病毒-药物混合物进行 50 倍稀释，可通过加入 9.8 ml 基础培养基（含 2% FBS 的细胞培养基）实现。
   注意：将药物稀释至亚治疗浓度可避免测试化合物与宿主细胞表面发生显著相互作用，从而允许检测处理对无细胞病毒颗粒的作用。需注意，该稀释比例取决于测试化合物针对特定病毒感染的抗病毒剂量反应，应在开展本项检测前预先确定。
4. 作为对照，将病毒与待测化合物混合后立即稀释至亚治疗浓度（不进行孵育），随后用于感染实验（图1A，短期）
5. 将100 μl稀释后的HCV-药物混合物加入Huh-7.5细胞单层中（此时病毒量为1 x 10² FFU；最终MOI = 0.01），在37 °C孵育3小时，以允许病毒吸附。
6. 感染后，移除稀释的接种物，用 200 μl PBS 轻柔洗涤孔板两次。
   注意： 轻柔地进行洗涤，以避免细胞脱落。
7. 向每个孔中加入100 μl基础培养基，在37 °C下孵育72小时。
8. 通过检测上清液中的荧光素酶活性来分析感染结果。

结果

图1. 测试化合物CHLA和PUG对病毒感染的灭活作用。 不同病毒在37 °C条件下，经测试化合物长时间（滴定前孵育1.5–3小时；浅灰色柱）或短时间（立即稀释；深灰色柱）处理后，稀释至亚治疗浓度，随后分析其对相应宿主细胞的感染情况。（A） 实验示意图（左侧展示），右侧表格中列出了每种病毒的最终病毒浓度（PFU/孔或MOI）、长期病毒-药物孵育时间（i）以及后续孵育时间（ii）。各附加图板分别展示（B） HCMV、（C） HCV、（D） DENV-2、...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	GIBCO	11995-040
FBS	GIBCO	26140-079
青霉素-链霉素	GIBCO	15070-063
两性霉素B	GIBCO	15290-018
DMSO	Sigma	D5879
体外毒理学检测试剂盒，基于XTT法	Sigma	TOX2
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
酶标仪	Thermo Scientific	89087-320
微量离心机	Thermo Scientific	75002420
BioLux Gaussia 荧光素酶检测试剂盒	New England Biolabs	E3300L
发光检测仪	Promega	GloMax-20/20
柠檬酸钠二水合物	Sigma	71402
氯化钾	Sigma	P5405