通过病毒灭活测定评估抗病毒测试化合物的有效性

1. 病毒灭活试验

注:图 1A 列出了各种病毒的潜伏期和病毒剂量的示例。也可以通过增加 MOI/PFU 来测试更高浓度的病毒。

1. 将 Huh-7.5 细胞接种在 96 孔板（每孔 1 × 10⁴ 个细胞）中，并在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱 O/N 中孵育以获得单层。
2. 孵育测试化合物或对照（终浓度为:CHLA = 50 μM;PUG = 50 μM;肝素 = 1,000 μg/mL;DMSO = 1%），HCV 颗粒在 37 °C 下以 1:1 的比例（图 1A，"长期"）进行。例如，向含有 1 x 104 FFU 的 100 μl 病毒接种物中加入 100 μl 100 μM CHLA 工作稀释液;这产生终浓度为 50 μM 的 CHLA 处理。
3. 将病毒-药物混合物稀释至测试化合物的"亚治疗"（无效）浓度。例如，CHLA 和 PUG 对 HCV 的无效浓度为 1 μM31;因此，这需要将病毒-药物混合物稀释 50 倍，这可以用 9.8 ml 基础培养基（含 2% FBS 的细胞培养基）完成><。 注意:稀释至亚治疗浓度可防止测试化合物与宿主细胞表面之间的显着相互作用，并允许检查对无细胞病毒粒子的处理效果。请注意，这种稀释度取决于测试化合物对特定病毒感染的抗病毒剂量反应，并在进行此特定测定之前确定。
4. 为了进行比较，将病毒与测试化合物混合，并在感染前立即稀释（无潜伏期）至亚治疗浓度（图 1A，"短期"）。
5. 将 100 μl 稀释的 HCV 药物混合物添加到 Huh-7.5 细胞单层上（病毒量现在为 1 x 10² FFU;最终 MOI = 0.01），并在 37 °C 下孵育 3 小时以允许病毒吸附。
6. 感染后，取出稀释的接种物，用 200 μl PBS 轻轻洗涤孔两次><。 注意:轻轻洗涤以避免抬起细胞。
7. 向每个孔中加入 100 μl 基础培养基，并在 37 °C 下孵育 72 小时。
8. 通过测定上清液的荧光素酶活性来分析所得感染。

图 1.测试化合物 CHLA 和 PUG 灭活病毒感染。在稀释至亚治疗浓度之前，用测试化合物在 37 °C 下用测试化合物处理不同的病毒（滴定前孵育 1.5 – 3 小时;浅灰色条）或短时间（立即稀释;深灰色条），然后对相应的宿主细胞进行感染分析。（A） 实验示意图（如左图所示），右表中每种病毒的最终病毒浓度（PFU/孔或 MOI）、长期病毒-药物潜伏期 （i） 和随后的潜伏期 （ii）。（B） HCMV、 （C） HCV 、 （D） DENV-2 、 （E） MV 和 （F） RSV 的分析在每个附加面板中显示。将结果与病毒感染的 DMSO 阴性对照处理作图，显示的数据是来自三个独立实验的平均值±标准误差 （SEM）。此图已根据参考进行了修改。