一种用于评估受试化合物对宿主细胞中病毒进入和融合影响的检测方法

摘要

来源：Tai, C., 等. 用于抗病毒化合物鉴定与评价的早期病毒进入检测方法. J. Vis. Exp. (2015).

本视频展示了一种用于评估靶向病毒进入宿主细胞及与内体融合特定步骤的抗病毒药物的检测方法。将细胞在低温下孵育，随后用丙型肝炎病毒（HCV）感染。低温条件允许病毒与宿主细胞结合，但通过内吞作用抑制其内化。via 内吞作用。加入待测抗病毒化合物后，将细胞转移至生理温度下孵育。温度升高可促进病毒进入，从而评估待测化合物对病毒包膜与内体融合的影响。

方案

注意：所有涉及细胞培养和病毒感染的操作必须在经过认证的生物安全柜中进行，且生物安全柜的防护等级需与所操作样本的生物安全等级相匹配。为描述实验方案，本研究采用海肾荧光素酶报告基因标记的丙型肝炎病毒（HCV）作为模型病毒。在代表性结果部分，使用柯里酸（chebulagic acid, CHLA）和石榴素（punicalagin, PUG）作为候选抗病毒化合物，用于靶向抑制病毒糖蛋白与细胞表面糖胺聚糖在病毒早期进入阶段的相互作用。肝素（heparin）因已知可干扰多种病毒的进入过程，在此作为阳性对照处理。

1. 细胞培养、化合物配制及化合物细胞毒性

1. 培养待分析病毒侵染系统所对应的细胞系（表1对于HCV，将Huh-7.5细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）、200 U/ml青霉素G、200 µg/ml链霉素和0.5 µg/ml两性霉素B的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。
2. 使用相应的溶剂配制待测化合物和对照品：例如，将CHLA和PUG溶于二甲基亚砜（DMSO）中；用无菌双蒸水配制肝素溶液。所有后续稀释步骤均使用培养基进行。
   注意：在实验中，测试化合物处理组中DMSO的终浓度低于1%；为便于比较，设1% DMSO作为阴性对照处理组。
3. 测定受试化合物的细胞毒性（例如，CHLA 和 PUG）对细胞的作用，采用 XTT（2,3-双[2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基]-5-苯胺基-羰基]-2H-四氮唑氢氧化物）等细胞活力检测试剂检测病毒感染情况：
   1. 对于HCV，在96孔板中接种Huh-7.5细胞（1 × 10⁴ 每孔细胞数）在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育₂ 孵育过夜以获得单层细胞。
   2. 在培养孔中分别加入DMSO对照（1%）或浓度递增的待测化合物CHLA和PUG（例如0、10、50、100和500 μM），每组设三个复孔。
   3. 37 °C 培养 72 小时，然后弃去培养板中的培养基，用 200 μl 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
   4. 加入100 µl基于XTT的检测溶液 体外 向每孔加入毒性检测试剂盒中的试剂，将培养板置于37 °C继续孵育3小时，以生成XTT甲臜。
   5. 使用微孔板读数仪在492 nm的检测波长和690 nm的参考波长下测定吸光度。
   6. 使用以下公式计算存活细胞百分比：细胞活力（%）= At / As × 100%，其中“At”和“As”分别代表测试化合物处理组和溶剂对照组（例如1% DMSO）的吸光度。确定50%细胞毒性浓度（CC₅₀根据制造商方案，使用 GraphPad Prism 等分析软件确定受试化合物的 ) 值。

2. 病毒感染的检测

注意：病毒感染的检测结果取决于所使用的病毒系统，可能涉及空斑试验或测量报告基因标记病毒的报告信号等方法。以下描述的是基于荧光素酶报告基因活性检测报告基因标记的丙型肝炎病毒感染的方法。

1. 收集感染孔中的上清液，在4 °C条件下，以17,000 × g离心5分钟，进行澄清。
2. 取20 μl待测上清液与Gaussia荧光素酶检测试剂盒中的50 μl荧光素酶底物混合，按照生产商说明书直接使用发光仪进行检测。
3. 以相对发光单位（RLU）的log₁₀值表示HCV感染活性，用于确定病毒抑制率（%），并根据生产商方案，采用GraphPad Prism软件中的算法计算受试化合物对HCV感染的50%有效浓度（EC₅₀）。

3. 病毒进入/融合实验

注意：不同病毒的孵育时间与病毒剂量示例见图1A“进入/融合”。也可通过提高感染复数（MOI/PFU）来测试更高浓度的病毒。

1. 将 Huh-7.5 细胞接种于 96 孔板中（每孔 1 × 10⁴ 个细胞），在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养，以形成单层细胞。
2. 将培养板中的细胞单层置于 4 °C 预冷 1 小时。
3. 在 4 °C 条件下用 HCV 感染细胞（感染复数 MOI = 0.01），持续 3 小时。例如，使用含有 1 × 10² 焦点形成单位（FFU）的 100 μl 病毒接种物。
   注意： 病毒接种物的添加应在冰上进行，随后在 4 °C 冰箱中孵育，以维持 4 °C 的温度环境，此条件允许病毒结合但不发生内化。
4. 吸除上清液，并用 200 μl 冰冷的 PBS 轻柔洗涤细胞单层两次。
   注意： 洗涤操作应轻柔，避免细胞脱落。
5. 向各孔加入待测化合物或对照物（终浓度分别为：CHLA = 50 μM；PUG = 50 μM；肝素 = 1,000 μg/ml；DMSO = 1%），在 37 °C 孵育 3 小时。例如，将 10 μl 的 500 μM CHLA 工作液加入 90 μl 培养基中，混匀后处理各孔；最终 CHLA 的处理浓度为 50 μM。
   注意： 从 4 °C 转移至 37 °C 可促进病毒进入/融合过程，从而可评估待测化合物对这一特定步骤的影响。
6. 吸除含药物的上清液，并通过使用 200 μl 柠檬酸盐缓冲液（50 mM 柠檬酸钠，4 mM 氯化钾，pH 3.0）或 PBS 洗涤，去除未内化的细胞外病毒。随后每孔加入 100 μl 基础培养基，在 37 °C 继续孵育 72 小时。
7. 按照“2. 病毒感染的检测读数”所述方法，通过检测上清液中的荧光素酶活性来分析最终的感染情况。

结果

表1：病毒感染的宿主细胞类型。 代表性结果中所述的每种病毒感染系统所使用的细胞类型均已标明。

病毒	细胞类型
HCMV	HEL
HCV	Huh-7.5
DENV-2	Vero
MV	CHO-SLAM
RSV	HEp-2

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	GIBCO	11995-040
FBS	GIBCO	26140-079
青霉素-链霉素	GIBCO	15070-063
两性霉素B	GIBCO	15290-018
DMSO	Sigma	D5879
基于XTT的体外毒理学检测试剂盒	Sigma	TOX2
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
酶标仪	Bio-Tek Instrument, Inc.	ELx800
微量离心机	Thermo Scientific	75002420
BioLux Gaussia 荧光素酶检测试剂盒	New England Biolabs	E3300L
发光检测仪	Promega	GloMax-20/20
柠檬酸钠二水合物	Sigma	71402
氯化钾	Sigma	P5405