一种用于评估受试化合物对宿主细胞中病毒进入和融合影响的检测方法

摘要

来源：Tai, C., 等. 用于抗病毒化合物鉴定与评价的早期病毒进入检测方法. J. Vis. Exp. (2015).

本视频展示了一种用于评估靶向病毒进入宿主细胞及与内体融合特定步骤的抗病毒药物的检测方法。将细胞在低温下孵育，随后用丙型肝炎病毒（HCV）感染。低温条件允许病毒与宿主细胞结合，但通过内吞作用抑制其内化。via 内吞作用。加入待测抗病毒化合物后，将细胞转移至生理温度下孵育。温度升高可促进病毒进入，从而评估待测化合物对病毒包膜与内体融合的影响。

方案

注意：所有涉及细胞培养和病毒感染的操作必须在经过认证的生物安全柜中进行，且生物安全柜的防护等级需与所操作样本的生物安全等级相匹配。为描述实验方案，本研究采用海肾荧光素酶报告基因标记的丙型肝炎病毒（HCV）作为模型病毒。在代表性结果部分，使用柯里酸（chebulagic acid, CHLA）和石榴素（punicalagin, PUG）作为候选抗病毒化合物，用于靶向抑制病毒糖蛋白与细胞表面糖胺聚糖在病毒早期进入阶段的相互作用。肝素（heparin）因已知可干扰多种病毒的进入过程，在此作为阳性对照处理。

1. 细胞培养、化合物配制及化合物细胞毒性

1. 培养待分析病毒侵染系统所对应的细胞系（表1对于HCV，将Huh-7.5细胞培养于添加了10%胎牛血清（FBS）、200 U/ml青霉素G、200 µg/ml链霉素和0.5 µg/ml两性霉素B的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。
2. 使用相应的溶剂配制待测化合物和对照品：例如，将CHLA和PUG溶于二甲基亚砜（DMSO）中；用无菌双蒸水配制肝素溶液。所有后续稀释步骤均使用培养基进行。
   注意：在实验中，测试化合物处理组中DMSO的终浓度低于1%；为便于比较，设1% DMSO作为阴性对照处理组。
3. 测定受试化合物的细胞毒性（例如，CHLA 和 PUG）对....

结果

表1：病毒感染的宿主细胞类型。 代表性结果中所述的每种病毒感染系统所使用的细胞类型均已标明。

病毒	细胞类型
HCMV	HEL
HCV	Huh-7.5
DENV-2	Vero
MV	CHO-SLAM
RSV	HEp-2

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	GIBCO	11995-040
FBS	GIBCO	26140-079
青霉素-链霉素	GIBCO	15070-063
两性霉素B	GIBCO	15290-018
DMSO	Sigma	D5879
基于XTT的体外毒理学检测试剂盒	Sigma	TOX2
PBS pH 7.4	GIBCO	10010023
酶标仪	Bio-Tek Instrument, Inc.	ELx800
微量离心机	Thermo Scientific	75002420
BioLux Gaussia 荧光素酶检测试剂盒	New England Biolabs	E3300L
发光检测仪	Promega	GloMax-20/20
柠檬酸钠二水合物	Sigma	71402
氯化钾	Sigma	P5405