利用改良石蕊试验比色检测细菌生物标志物

摘要

来源：Tram, K., 等. 利用石蕊试验进行细菌的比色检测. 视觉化实验杂志 (2016).

本视频演示了一种比色法 E. coli 检测方法，包括一种 E. coli 生物标志物激活DNAzyme，导致RNA连接处断裂以及DNAzyme-尿素酶偶联物的释放。随后通过比色法检测 E. coli 通过氨诱导的pH变化检测生物标志物。

方案

1. 准备 E. coli 用于检测的细胞

1. 为获得所需的细胞悬液，取1 ml培养物转移至1.5 ml微量离心管中。
2. 在4 °C条件下，以6,000 × g 离心10分钟，小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。
3. 向细胞沉淀中加入10 µl反应缓冲液并重悬细胞。将细胞悬液超声处理5分钟，随后转移至冰盒中孵育5分钟。
4. 再次将细胞悬液超声处理5分钟。
5. 在4 °C条件下，以13,000 × g 离心10分钟，取上清液用于检测（10 µl）。

2. 石蕊测试

1. 在1.5 ml的微量离心管中，加入100 µl反应缓冲液（RB），涡旋混匀，预洗离心管，然后弃去缓冲液。
2. 将15 µl已组装的EC1转移至已清洗的微量离心管中。
3. 将微量离心管置于磁力架上，清洗磁珠：用移液器吸除上清液。将离心管从磁力架上取下，加入100 µl RB，轻轻重悬磁珠。
4. 重复步骤2.3，再清洗磁珠两次。
5. 将微量离心管重新放回磁力架上，吸除上清液，然后加入10 µl来自步骤1.3制备的E. coli样品。
6. 通过轻轻敲击微量离心管，小心混匀样品与磁珠。
7. 在室温下孵育反应体系1小时。
8. 向反应体系中加入90 µl ddH₂O，并将微量离心管置于磁力架上。
9. 磁分离约3分钟后，小心吸取85 µl上清液转移至0.5 ml微量离心管中。吸取上清液时应缓慢操作，避免吸入任何磁珠。
10. 向上述微量离心管中加入15 µl 0.04%酚红溶液和100 µl底物溶液。
11. 在特定时间间隔拍照，记录颜色变化。
    注意：也可使用带微电极的pH计监测pH变化。起始pH应约为5.2–5.5（溶液呈黄色）。若不符合，可通过添加pH 5.0的1 mM乙酸盐缓冲液调节溶液pH。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙二胺四乙酸（EDTA）	VWR AMRESCO	105
氢氧化钠（NaOH）颗粒	BIO BASIC CANADA INC	SB6789
Tris碱	VWR AMRESCO	497
尿素	VWR AMRESCO	M123
二甲苯青FF	SIGMA-ALDRICH	X-4126
0.04% 酚红	SIGMA-ALDRICH	P3532
10x T4多核苷酸激酶反应缓冲液	Lucigen	30061-1
大肠杆菌K12（MG1655）	ATCC	ATCC700926
磁珠（BioMag）	Bangs Laboratories Inc
磁力分离架	New England BioLabs	S1506S
微量离心管	Sarstedt	72.69
细胞培养孵育箱	Eppendorf Scientific	M13520000
Branson超声清洗仪	Branson	N/A