一种用于研究痘病毒感染细胞中翻译调控的荧光素酶报告基因检测方法

摘要

来源：Dhungel, P.，等。基于体外转录RNA的荧光素酶报告基因检测法研究痘病毒感染细胞中的翻译调控。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了一种用于研究痘病毒感染细胞中翻译调控的检测方法。将未感染和病毒感染的细胞共同转染编码萤火虫荧光素酶（Fluc）和海肾荧光素酶（Rluc）的mRNA，其中Fluc mRNA含有5'端Poly(A)前导序列。在向裂解细胞加入生物发光底物后，检测两种荧光素酶的信号，以确定由前导序列赋予Fluc mRNA在病毒感染细胞中的翻译优势。

方案

1. 将 mRNA 转染至细胞

1. 将HeLa细胞接种于24孔板中（次日细胞融合度约为80-90%），在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育过夜。
2. 用痘苗病毒（VACV）以感染复数（MOI）为5的条件感染HeLa细胞，或保留未感染的HeLa细胞作为对照。
   注意：MOI是指每个细胞所对应的感染性病毒颗粒数量。
3. MOI为X时的病毒用量= {[(细胞数量 × X) / 病毒滴度] × 1000} µl 病毒/1 mL培养基。
4. 在所需的感染后时间点（hpi）（本实验为感染后10-12小时），使用阳离子脂质转染试剂将mRNA（每孔24孔板转染总mRNA 500 ng）转染入细胞，如图1C所示。
   1. 对于24孔板的一个孔，在一个微量离心管中混合480 ng携带12A序列的萤火虫荧光素酶（12A-Fluc）mRNA和20 ng携带Kozak序列的Renilla荧光素酶（Kozak-Rluc）mRNA；在另一个微量离心管中加入1.1 µL阳离子脂质转染试剂。
   2. 在两个管中各加入55 µL低血清培养基，混匀后室温孵育5分钟。
   3. 孵育5分钟后，将含低血清培养基的55 µL阳离子脂质转染试剂加入含有mRNA的管中。
   4. 轻轻但充分混匀，室温孵育15分钟。
   5. 孵育期间，吸除细胞培养基，每孔24孔板加入400 µL低血清培养基。
   6. 孵育结束后，将100 µL转染混合物逐滴均匀加入24孔板的一个孔中。

2. 检测荧光素酶活性

1. 共转染12A-Fluc和Kozak-Rluc mRNA后5小时，使用能够进行双报告基因检测的荧光素酶检测系统（例如，Dual-Luciferase Reporter Assay Kit）测定荧光素酶活性。
2. 移除低血清培养基，加入 150 µL 1x 裂解缓冲液（荧光素酶检测试剂盒组分）裂解细胞。
3. 室温孵育10分钟后，刮取细胞收集裂解液，并转移至微量离心管中。
4. 将裂解液在12,000 x g 在4°C下离心10分钟以沉淀细胞碎片。
5. 在不透光的96孔白色固底检测板中加入30 µL上清液。
6. 使用荧光素酶检测试剂盒和多功能酶标仪测量双发光信号。
7. 使用动力学功能（按孔为单位）进行测量，参数设置参照所述内容 表1.
   注意： 也可使用手动 luminometer 进行检测。在比色皿中加入等体积的裂解液和 Fluc 底物，孵育 2 秒后，用 luminometer 测量 10 秒。完成 Fluc 检测后，迅速将比色皿从 luminometer 中取出，并手动加入等体积的 Rluc 底物。再次等待 2 秒，然后用 luminometer 测量 10 秒。
8. 将发光读数数据导出为所需的文件格式。
9. 通过将未感染和VACV感染的HeLa细胞中12A-Fluc mRNA的Fluc值除以内参Rluc值，确定其相对翻译速率。
   注：图2 展示了从原始数据逐步分析以获得相对 Fluc 活性的过程。

表1：荧光素酶检测设置——使用推荐体积或时间进行荧光素酶检测的步骤。

步骤	体积/时间
加入荧光素酶检测底物（Fluc）：	30 µL
等待 / 孵育时间：	2 s
荧光检测（Fluc）：	10 s
加入Stop & Glo底物（Rluc）：	30 µL
等待 / 孵育时间：	2 s
荧光检测（Rluc）：	10 s

结果

图1：mRNA合成与转染 (A) 示意图 体外 转录。以PCR扩增的DNA为模板，该DNA包含位于目标5'-UTR下游的荧光素酶基因以及T7启动子。T7 RNA聚合酶结合至启动子，并从5'到3'方向添加白色所示的核糖核苷酸。当mRNA长度达到25-30个核苷酸时，使用抗反向帽类似物（ARCA）添加m7G帽结构。B) RNA 条带来自 体外 使用1.5% TBE琼脂糖凝胶电泳检测转录产物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Corning 96 孔半面积白色平底聚苯乙烯微孔板	Corning	3693	不透明壁 96 孔白色固底板
Dual-Luciferase 报告基因检测系统	Promega	E1960	Dual-Luciferase 检测试剂盒 (DLAK)
GloMax Navigator 微孔板化学发光仪	Promega	GM2010	又称多功能微孔板化学发光检测仪
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019	阳离子脂质转染试剂
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070	减血清培养基