一种用于测定抗生素最低抑菌浓度的微量滴定板法

摘要

来源：Ketelboeter, L. M.，等。抑制细菌脓黑色素生成及其对氧化应激敏感性增加的检测方法。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种基于微量滴定板的方法，用于测定受试抗生素对细菌的最低抑菌浓度（MIC）。将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）悬浮液加入含有系列稀释受试抗生素以及细菌吡咯黑色素生成抑制剂的微量滴定板中，随后测定各孔的光密度，以计算抗生素的最低抑菌浓度，并评估吡咯黑色素生成抑制剂对细菌抗生素敏感性的影响。

方案

1. 96孔板中抗生素最低抑菌浓度（MIC）测定

1. 在含有或不含 NTBC（2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮）的 LB（Luria-Bertani）培养基中，设置待测菌株的过夜培养物。
   注意：本方案以 300 µM NTBC 作为代表性浓度进行描述。
   1. 向 2 ml LB 培养基中加入 300 µM NTBC。对于不含 NTBC 的条件，向 2 ml LB 中加入等体积的溶剂（二甲基亚砜，DMSO）。
   2. 使用无菌牙签，将单个细菌菌落接种至试管中。每种菌株分别设置一个含 NTBC 和一个不含 NTBC 的培养物。在 37 °C 条件下，使用组织培养旋转仪在空气培养箱中振荡培养过夜。
2. 次日，配制用于建立 MIC 检测的 LB + NTBC 和 LB + DMSO 主溶液。NTBC 的浓度应为 600 µM，因为在加入接种物后将被两倍稀释，最终浓度为 300 µM。
   1. 若需对一种菌株测试一种抗生素，向 2 ml LB 中加入 600 µM NTBC 并混匀，制成 NTBC 主溶液；向 2 ml LB 中加入等体积的溶剂（DMSO）并混匀，制成不含 NTBC 的主溶液。这些溶液可用于制备抗生素储备液，以及在 96 孔板中建立稀释系列。
      注意：主溶液的....

结果

图1：抗生素MIC实验96孔板设置示意图。（A）A行各孔中含有100 µl起始最高浓度的2倍浓缩抗生素溶液。B至H行各孔加入50 µl不含抗生素的LB + NTBC或LB + DMSO。（B）在A至G行中进行两倍系列稀释，使每孔中抗生素稀释后体积为50 µl，浓度为最终所需浓度的2倍。H行为不含抗生素的细菌生长对照孔。向相应孔中加入50 µl LB或菌液，使抗生素进一步稀释两倍至最终浓度。LB作为抗生素中细菌污染的对照。Gm，庆大霉素；Km，卡那霉素；Tob，妥布霉素

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮（NTBC）	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	也称为尼替西农。可溶于DMSO。
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O. 稳定化。
庆大霉素	Gold Bio	G-400-100	可溶于 H2O. 过滤除菌。
卡那霉素	Fisher Scientific	BP906-5	可溶于 H2O. 过滤除菌。
妥布霉素	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	可溶于 H2O. 过滤除菌。