一种用于测定抗生素最低抑菌浓度的微量滴定板法

摘要

来源：Ketelboeter, L. M.，等。抑制细菌脓黑色素生成及其对氧化应激敏感性增加的检测方法。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了一种基于微量滴定板的方法，用于测定受试抗生素对细菌的最低抑菌浓度（MIC）。将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）悬浮液加入含有系列稀释受试抗生素以及细菌吡咯黑色素生成抑制剂的微量滴定板中，随后测定各孔的光密度，以计算抗生素的最低抑菌浓度，并评估吡咯黑色素生成抑制剂对细菌抗生素敏感性的影响。

方案

1. 96孔板中抗生素最低抑菌浓度（MIC）测定

1. 在含有或不含 NTBC（2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮）的 LB（Luria-Bertani）培养基中，设置待测菌株的过夜培养物。
   注意：本方案以 300 µM NTBC 作为代表性浓度进行描述。
   1. 向 2 ml LB 培养基中加入 300 µM NTBC。对于不含 NTBC 的条件，向 2 ml LB 中加入等体积的溶剂（二甲基亚砜，DMSO）。
   2. 使用无菌牙签，将单个细菌菌落接种至试管中。每种菌株分别设置一个含 NTBC 和一个不含 NTBC 的培养物。在 37 °C 条件下，使用组织培养旋转仪在空气培养箱中振荡培养过夜。
2. 次日，配制用于建立 MIC 检测的 LB + NTBC 和 LB + DMSO 主溶液。NTBC 的浓度应为 600 µM，因为在加入接种物后将被两倍稀释，最终浓度为 300 µM。
   1. 若需对一种菌株测试一种抗生素，向 2 ml LB 中加入 600 µM NTBC 并混匀，制成 NTBC 主溶液；向 2 ml LB 中加入等体积的溶剂（DMSO）并混匀，制成不含 NTBC 的主溶液。这些溶液可用于制备抗生素储备液，以及在 96 孔板中建立稀释系列。
      注意：主溶液的配制量应略多，以补偿移液误差。可根据所测试抗生素和菌株的数量，按需调整主溶液的配制量。
3. 在 LB + NTBC 或 LB + DMSO 主溶液中配制抗生素溶液。
   注意：这些溶液中的抗生素浓度应为最终所需浓度的两倍。应配制足够体积的溶液，以便向 96 孔板中的四个孔各转移 100 µl。
   1. 配制浓度为 64 µg/ml 的庆大霉素（±NTBC）储备液。将 0.288 µl 庆大霉素原液（100 mg/ml）加入 450 µl LB + NTBC 或 LB + DMSO 主溶液中，混匀。
      ​注意：Pseudomonas aeruginosa PAO1 的庆大霉素最大浓度为 32 µg/ml。
   2. 配制浓度为 256 µg/ml 的卡那霉素（±NTBC）储备液。将 3.84 µl 卡那霉素原液（30 mg/ml）加入 450 µl LB + NTBC 或 LB + DMSO 主溶液中，混匀。
      注意：P. aeruginosa PAO1 的卡那霉素最大浓度为 128 µg/ml。
   3. 配制浓度为 8 µg/ml 的妥布霉素（±NTBC）储备液。将 0.36 µl 妥布霉素原液（10 mg/ml）加入 450 µl LB + NTBC 或 LB + DMSO 主溶液中，混匀。
      注意：P. aeruginosa PAO1 的妥布霉素最大浓度为 4 µg/ml。
      注意：可根据待测细菌种类调整抗生素种类及其浓度。
4. 将每种 2 倍浓度的抗生素溶液各 100 µl 加入 96 孔板中的四个孔，置于 A 行。例如，庆大霉素应加入 A1 至 A4 孔，卡那霉素应加入 A5 至 A8 孔，妥布霉素应加入 A9 至 A12 孔。参见 图 1A 中 96 孔板设置示意图。
   注意：可在同一块板上测试多种抗生素，但每块板仅应测试一种菌株，以避免其他菌株可能造成的交叉污染。
5. 向 96 孔板的 B 至 H 行各孔中加入 50 µl LB + NTBC 或 LB + DMSO 主溶液。确保一块板使用 LB + NTBC，另一块板使用 LB + DMSO。参见 图 1A。
   1. LB + NTBC 主溶液用于含 NTBC 的抗生素组；LB + DMSO 主溶液用于含 DMSO 的抗生素组。
6. 使用微量移液器，通过将 A 行溶液 50 µl 转移至 B 行进行抗生素的两倍系列稀释。混匀后更换吸头，再将 B 行 50 µl 溶液转移至 C 行，依此类推，直至完成所有行的稀释。稀释至 G 行后，从中取出 50 µl 溶液弃去。H 行作为空白对照，用于检测细菌生长情况。参见 图 1B。
   注意：A 至 G 行各孔现含有 50 µl 抗生素溶液，其在 LB + NTBC 或 LB + DMSO 中的浓度为最终所需浓度的两倍。H 行则仅含 LB + NTBC 或 LB + DMSO，不含抗生素。
7. 测定过夜培养物的 OD₆₀₀。在测定 OD₆₀₀ 前，需对所有培养物进行洗涤，以去除培养基中残留的绿脓菌素。
   1. 取 1 ml 培养物，在微量离心机中以 16,000 × g 离心 2 分钟进行洗涤。用微量移液器吸除上清液，将菌体沉淀重悬于 1 ml LB 培养基中。
8. 将过夜培养物用 LB 培养基稀释至 2.75×10⁵ CFU/ml。
   注意：假设 P. aeruginosa 的 1 个 OD₆₀₀ 单位相当于 1×10⁹ CFU/ml。其他细菌的 OD 与 CFU/ml 换算关系可能不同。
9. 向相应孔中加入 50 µl 稀释后的细菌培养物。
   注意：在 NTBC 中培养的菌液应加入含 NTBC 的孔中，在 DMSO 中培养的菌液应加入含 DMSO 的孔中。参见 图 1B。
   1. 每种菌株和抗生素浓度对应三个孔加入细菌，第四个孔加入 50 µl LB 作为细菌污染的阴性对照。参见 图 1B。
   2. 使用多通道微量移液器接种各孔。加样时应确保吸头接近孔底，以防止污染邻近孔。
      注意：加入细菌培养物后，抗生素和 NTBC 的浓度将被两倍稀释。
10. 用封口膜覆盖 96 孔板，在 37 °C 静置培养约 24 小时。将 96 孔板置于空气培养箱中静置培养。
11. 观察各孔中细菌的生长情况。MIC（最低抑菌浓度）定义为：在每种菌株的三个重复孔中均未观察到细菌生长的最低抗生素浓度。
    1. 通过肉眼观察或使用酶标仪在 OD₆₀₀ 波长下读取结果。

结果

图1：抗生素MIC实验96孔板设置示意图。（A）A行各孔中含有100 µl起始最高浓度的2倍浓缩抗生素溶液。B至H行各孔加入50 µl不含抗生素的LB + NTBC或LB + DMSO。（B）在A至G行中进行两倍系列稀释，使每孔中抗生素稀释后体积为50 µl，浓度为最终所需浓度的2倍。H行为不含抗生素的细菌生长对照孔。向相应孔中加入50 µl LB或菌液，使抗生素进一步稀释两倍至最终浓度。LB作为抗生素中细菌污染的对照。Gm，庆大霉素；Km，卡那霉素；Tob，妥布霉素

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰基]-1,3-环己二酮（NTBC）	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	也称为尼替西农。可溶于DMSO。
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 wt. % in H2O. 稳定化。
庆大霉素	Gold Bio	G-400-100	可溶于 H2O. 过滤除菌。
卡那霉素	Fisher Scientific	BP906-5	可溶于 H2O. 过滤除菌。
妥布霉素	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	可溶于 H2O. 过滤除菌。