一种研究细胞外基质刚度对细菌感染影响的检测方法

摘要

来源：Bastounis, E. E.，等。一种基于多孔聚丙烯酰胺的实验方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种用于研究细胞外基质（ECM）硬度对黏附细胞细菌感染影响的实验方法。将不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶覆盖胶原蛋白后，分层置于多孔板中，以模拟生理条件下ECM的硬度。将人内皮细胞接种于水凝胶表面，并用经基因工程改造、可在细胞内表达荧光蛋白的单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）感染细胞后，通过流式细胞术比较位于较硬水凝胶与较软水凝胶上的细胞中内化细菌的数量。

方案

1. 在多孔板上制备薄双层聚丙烯酰胺（PA）水凝胶

1. 聚丙烯酰胺水凝胶的制备
   注：参见图1。
   1. 配制含有3–10%的40%储备丙烯酰胺溶液（见材料表）和0.06–0.6%的2%储备双丙烯酰胺溶液（见材料表）的水溶液，以制备弹性模量可调、范围从0.6 kPa至70 kPa的水凝胶。参见表1。
      1. 制备0.6 kPa水凝胶时，混合3%丙烯酰胺与0.045%双丙烯酰胺；制备3 kPa水凝胶时，混合5%丙烯酰胺与0.074%双丙烯酰胺；制备10 kPa水凝胶时，混合10%丙烯酰胺与0.075%双丙烯酰胺；制备20 kPa水凝胶时，混合8%丙烯酰胺与0.195%双丙烯酰胺；制备70 kPa水凝胶时，混合10%丙烯酰胺与0.45%双丙烯酰胺。
         注：有关实现理想聚丙烯酰胺水凝胶刚度的更多细节可参见其他文献。
   2. 为每种目标刚度的水凝胶分别配制两种水溶液：溶液1不含微珠，溶液2含有0.03%直径为0.1 µm的荧光微珠（见材料表）。
   3. 将溶液1和溶液2在真空条件下脱气15分钟，以去除已知会抑制溶液聚合的氧气。
   4. 向溶液1中加入0.6%的10 g/mL过硫酸铵（APS）储备液和0.43%四甲基乙二胺（TEMED），以启动聚合反应。操作需迅速。
   5. 将3.6 µL溶液1滴加至24孔板各孔的中心位置。
   6. 立即用12 mm未处理的圆形盖玻片覆盖各孔，并静置20分钟，使溶液1充分聚合。
   7. 轻敲注射器针头使其尖端形成微小钩状，以便于移除盖玻片。使用注射器针头小心提起盖玻片。
   8. 向溶液2中加入0.6%的10 g/mL APS储备液和0.43% TEMED。将2.4 µL混合液滴加至24孔板各孔第一层水凝胶的上方。
   9. 用12 mm圆形玻璃盖玻片覆盖溶液2，并用镊子轻轻向下按压，确保第二层厚度尽可能薄。静置20分钟使其聚合。
   10. 向各孔中加入500 µL 50 mM HEPES（pH 7.5），然后用注射器针头和镊子移除玻璃盖玻片。
2. 聚丙烯酰胺水凝胶的灭菌、胶原包被与平衡
   1. 在组织培养超净台中对水凝胶进行1小时的紫外照射，以实现灭菌。
   2. 配制含0.5%（质量/体积）磺基琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮-2′-硝基苯氨基)己酸酯（Sulfo-SANPAH，见材料表）的溶液，溶剂为1% DMSO和50 mM HEPES（pH = 7.5）。
   3. 向水凝胶上表面加入200 µL上述溶液。迅速操作，并在302 nm紫外光下照射10分钟以活化表面。
   4. 用1 mL 50 mM HEPES（pH = 7.5）洗涤水凝胶两次。必要时可重复洗涤，以确保彻底去除未反应的交联剂。
   5. 在水凝胶上加入200 µL浓度为0.25 mg/mL的大鼠尾胶原I型（见材料表）溶液进行蛋白包被。将水凝胶置于室温下孵育过夜，胶原溶液覆盖于其上。
      注：为防止脱水或蒸发，将多孔板置于次级容器中，并在容器内周缘放置经水浸湿的实验室清洁纸巾。
   6. 使用落射荧光或共聚焦显微镜配合40倍物镜测量水凝胶的厚度。通过确定水凝胶底部（玻璃表面位置）和顶部平面（荧光微珠信号最强处）的z坐标位置，相减后计算其高度。
      注：本研究使用倒置落射荧光显微镜配合数值孔径为0.65的40倍物镜测量水凝胶厚度。此时也可进行原子力显微镜（AFM）测量以确认水凝胶的确切刚度（参见图2）。
   7. 在水凝胶上接种目标细胞前，向各孔加入1 mL培养基，并在37 ˚C孵育30分钟至1小时，以确保环境平衡。
      注：本研究加入MCDB-131完全培养基，因为该培养基是模型宿主细胞（HMEC-1）的培养所用培养基（详见步骤2.1）。

2. 人微血管内皮细胞在水凝胶上的培养与接种

1. 在含有MCDB-131培养基的完全培养基中培养HMEC-1（人微血管内皮）细胞，该完全培养基需添加10%胎牛血清、10 ng/mL表皮生长因子、1 µg/mL氢化可的松和2 mM L-谷氨酰胺（参见材料表）。
2. 每3至4天将汇合的细胞按1:6比例传代，细胞使用至第40代为止。
3. 实验前一天，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA将细胞从培养容器中消化下来。首先用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞及培养容器1次，然后加入适量0.25%胰蛋白酶/EDTA（每100 mm培养皿或75 cm²培养瓶加2 mL，每60 mm培养皿或25 cm²培养瓶加1 mL），于37 °C孵育5至10分钟，使细胞从基质上脱落。
4. 加入适量MCDB-131完全培养基以中和胰蛋白酶活性，轻轻吹打使细胞团块分散，随后将细胞悬液转移至锥形离心管中。
5. 轻轻混匀细胞悬液以确保细胞分布均匀，取20 µL悬液，极其轻柔地将盖玻片下方血细胞计数板的两个计数室充满。
6. 将含有细胞悬液的锥形离心管在500 × g条件下离心10分钟，使细胞沉淀。
7. 在离心的10分钟等待期间，使用血细胞计数板进行细胞计数。在显微镜下用10倍物镜对准血细胞计数板的网格线，使用手动计数器统计其中一个1 mm × 1 mm方格内的细胞数量。
8. 将血细胞计数板移至另一个1 mm × 1 mm方格，计数该区域细胞，并重复此过程再进行两次。计算四次计数的平均值，再将该平均值乘以10⁴，所得结果即为正在离心的细胞悬液中每毫升的活细胞数。
9. 小心吸除锥形离心管中的上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于MCDB-131完全培养基中，调整细胞浓度至4 × 10⁵ 个细胞/mL。
10. 将细胞悬液接种到水凝胶上，首先移除水凝胶孵育所用的培养基，然后在每块水凝胶上加入1 mL细胞悬液。

3. 人微血管内皮细胞的感染 L. monocytogenes

1. 感染前3天，根据需要从-80 °C保存的甘油菌种中划线接种待用的Lm菌株至含7.5 µg/mL氯霉素和200 µg/mL链霉素的BHI琼脂平板上。
   注意： 待划线的菌株可以是野生型或突变型，可组成型表达荧光（免疫染色使用JAT1045），或在ActA启动子下表达荧光（流式细胞术或牵引力显微镜实验使用JAT983或JAT985）。
2. 将平板置于37 °C培养，直至形成单个菌落（1 - 2天）。
3. 感染前一天，将目标菌株在含7.5 µg/mL氯霉素（如适用）的BHI培养基中，于30 °C、150 rpm条件下振荡培养过夜。
   1. 在15 mL圆锥形离心管中加入5 mL BHI培养基，加入7.5 µg/mL氯霉素（如适用），然后使用无菌10 µL枪头从琼脂平板接种单个菌落。
4. 第二天，在感染前，取样品用BHI培养基按1:5稀释后，于600 nm波长处测定细菌溶液的光密度（OD600）；使用仅含BHI的比色皿作为空白对照。
5. 将过夜培养物稀释至OD600为0.1，加入含7.5 µg/mL氯霉素（如适用）的BHI培养基中，于30 °C振荡培养2 h，使细菌达到对数生长期。
6. 测量菌液的OD600，预期值约为0.2 - 0.3。如果OD600过高，则用BHI单独稀释至0.2 - 0.3。
7. 取1 mL细菌溶液至微量离心管中，在室温下以2,000 × g离心4分钟。弃去上清液，在组织培养超净台中将细菌沉淀重悬于1 mL组织培养级PBS中。在室温下以2,000 × g再次离心4分钟，重复此洗涤步骤两次。每次均弃去上清液，最后将细菌重悬于1 mL PBS中。
8. 通过将重悬于PBS中的10或50 µL细菌与1 mL MCDB-131完全培养基混合，制备感染混合液，以获得感染复数（MOI； 即每个宿主细胞内的细菌数量（即每个宿主细胞的细菌数）约为50个或10个。
9. 从24孔板的各孔中移除培养基，注意不要破坏水凝胶或细胞。用1 mL MCDB-131完全培养基将细胞洗涤1次，然后向每孔加入1 mL细菌。
10. 用培养皿盖盖住培养皿，并用聚乙烯保鲜膜包裹培养皿以防止泄漏。将培养皿放入离心机，于200 × g离心10分钟，以同步化侵袭过程。随后将培养皿转移至组织培养孵箱，于37 °C孵育30分钟。
11. 用 MCDB-131 完全培养基将样品洗涤 4 次，并转移至组织培养孵箱中。再孵育 30 分钟后，更换为添加 20 µg/mL 庆大霉素的培养基。

4. 流式细胞术定量分析细胞外基质刚度依赖性宿主细胞感染易感性

1. 称取5 mg胶原酶，放入15 mL圆锥形离心管中，加入10 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，充分混匀。
2. 感染后8 h，从24孔板的各孔中移除培养基，用组织培养用PBS洗涤1次。吸除PBS后，向每孔加入200 µL胰蛋白酶-EDTA/胶原酶混合液。将板置于组织培养孵箱中孵育10 min，以确保细胞完全脱落。
3. 每孔使用新的移液器，将混合液轻柔吹打8次，注意动作轻柔以避免损伤细胞。向每孔加入200 µL完全培养基以中和胰蛋白酶活性。
4. 将每孔400 µL细胞悬液转移至带有35 µm细胞筛网帽的5 mL聚苯乙烯管中（参见材料表）。
5. 通过流式细胞术对每个样本分析10,000–20,000个细胞。利用流式细胞仪进行数据采集，并使用相应的 commercially available 软件确定每孔中被感染细胞的百分比。使用前向散射光与侧向散射光图（FSC vs SSC）对细胞计数分布的主要群体设门。
   注意：此步骤可确保分析单个细胞，并排除碎片或细胞双联体、三联体。
   1. 检测未感染对照细胞的荧光信号，并设门排除自发荧光，以确定被感染细胞群体。

表1. 不同硬度的聚丙烯酰胺（PA）水凝胶的组成。 本表中，不同列分别列出了为达到特定硬度（杨氏模量，E）所需的40%丙烯酰胺母液和2%双丙烯酰胺母液的百分比。

杨氏模量（E，kPa）	丙烯酰胺浓度 %（来自 40% 储液）	双丙烯酰胺浓度 %（来自 2% 储液）
0.6	3	0.045
3	5	0.075
10	10	0.075
20	8	0.195
70	10	0.45

结果

图1：定植于不同硬度的含荧光微珠双层薄型聚丙烯酰胺（PA）水凝胶上的宿主细胞的细菌感染检测。A. 对玻璃盖玻片进行化学修饰以实现水凝胶的附着。B. 在玻璃底面上滴加3.6 µL的PA混合液。C. 用一片直径12 mm的圆形玻璃盖玻片覆盖混合液以促进聚合。D. 使用针头注射器移除盖玻片。E. 在底层之上加入2.4 µL含微珠的PA溶液，并加盖圆形玻璃盖玻片。F. 向孔中加入缓冲液，然后移除盖玻片。G. 经1小时紫外照射以确保灭菌。H...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
氢氧化钠颗粒	Fisher	S318-500
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma	A3648
25% 戊二醛	Sigma	G6257-100ML
40% 丙烯酰胺	Sigma	A4058-100ML
双丙烯酰胺溶液 (2% w/v)	Fisher Scientific	BP1404-250
羧基修饰的荧光微球，0.1 μm，黄绿色荧光 (505/515)	Invitrogen	F8803
过硫酸铵	Fisher	BP17925
TEMED	Sigma	T9281-25ML
Sulfo-SANPAH	Proteochem	c1111-100mg
大鼠I型胶原蛋白溶液	Sigma	C3867-1VL
二甲基亚砜 (DMSO)	J.T. Baker	9224-01
HEPES，游离酸	J.T. Baker	4018-04
Leibovitz L-15 培养基，无酚红	Thermofischer	21083027
MCDB 131 培养基，无谷氨酰胺	Life technologies	10372019
基础胎牛血清，批号：A37C48A	Gemini Bio-Prod	900108 500ml
表皮生长因子 (EGF)	Sigma	E9644
氢化可的松	Sigma	H0888
L-谷氨酰胺 200 mM	Fisher	SH3003401
DPBS 1X	Fisher	SH30028FS
硫酸庆大霉素	MP biomedicals	194530
氯霉素	Sigma	C0378-5G
Difco™ 琼脂，颗粒状	BD	214530
BBL™ 脑心浸液	BD	211059
Hoechst 33342，三盐酸盐三水合物 — 水中 10 mg/μl 溶液	Invitrogen	H3570
16% 电镜级甲醛	Electron microscopy	15710-S
单核细胞增生李斯特菌抗体	Abcam	ab35132
山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor® 546 标记	Thermofischer	A-11035
0.25% 胰蛋白酶-EDTA，含酚红	Thermofischer	25200056
梭菌胶原酶	Sigma	C8051
硫酸链霉素	Fisher Scientific	3810-74-0
蔗糖	Calbiochem	8510
十二烷基硫酸钠	Thermofischer	28364
MES 粉末	Sigma	M3885
KCl	J.T. Baker	3040-05
MgCl₂	J.T. Baker	2444-1
EGTA	Acros	40991
一次性实验器材
12 mm 圆形玻璃盖玻片	Fisherbrand	12-545-81	No. 1.5 盖玻片 | 10 mm 玻璃直径 | 未包被
玻璃底 24 孔板	Mattek	P24G-1.5-13-F
5 ml 聚苯乙烯管，带 35 μm 细胞筛帽	Falcon	352235
T-25 培养瓶	Falcon	353118
50 ml 锥形管	Falcon	352070
15 ml 锥形管	Falcon	352196
一次性移液管 (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)	Falcon	357551
巴斯德玻璃移液管	VWR	14672-380
移液器吸头 (1–200 μl, 101–1000 μl)	Denville	P1122, P1126
无粉检查手套	Microflex	XC-310
细菌比色皿	Sarstedt	67.746
剃刀	VWR	55411-050
注射器针头	BD	305167
0.2 μm 灭菌瓶	Thermo Scientific	566-0020
20 ml 注射器	BD	302830
0.2 μm 滤器	Thermo Scientific	723-2520
木棒	Grainger	42181501
保鲜膜	Santa Cruz Biotechnologies	sc-3687
细菌培养皿	Falcon	351029
大型/非一次性实验设备
组织培养罩	Baker	SG504
血细胞计数板	Sigma	Z359629
细菌培养箱	Thermo Scientific	IGS180
组织培养箱	NuAire	NU-8700
真空室/脱气装置	Belart	42025	37 °C 和 5% CO₂
尼康倒置 Diaphot 200 落射荧光显微镜	Nikon	NIKON-DIAPHOT-200
笼式培养箱	Haison	Custom
Stanford FACScan 分析仪	Stanford 和 Cytek 升级的 FACScan	Custom
移液器辅助器	Drummond	4-000-110
移液器 (10 μl, 200 μl, 1000 μl)	Gilson	F144802, F123601, F123602
pH 计	Mettler Toledo	30019028
镊子	FST	11000-12
1 L 烧瓶	Fisherbrand	FB5011000
高压灭菌器	Amsco	3021
磁力搅拌板	Bellco	7760-06000
磁力搅拌子	Bellco	1975-00100
分光光度计	Beckman	DU 640
Stanford FACScan 分析仪	Cytek Biosciences	Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan
软件
显微镜软件 (μManager)	Open Imaging
Matlab	Matlab Inc
Flowjo	FlowJo, LLC
自动图像分析软件 CellC	https://sites.google.com/site/cellcsoftware/		该软件可免费获取。可执行文件和 MATLAB 源代码可在 https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ 下载