定量延时显微镜技术用于评估细胞外基质刚度依赖性细菌扩散

摘要

来源：Bastounis, E. E. 等，一种基于多孔聚丙烯酰胺的实验方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了用于评估细胞外基质刚度依赖性的定量延时显微镜技术 单核细胞增生李斯特菌 通过内皮细胞的播散。与较硬的水凝胶相比，较软的水凝胶可促进细菌更快地通过内皮细胞播散，凸显了基质刚度对细菌播散的影响。

方案

1. 在多孔板上制备薄双层聚丙烯酰胺（PA）水凝胶

1. 将过硫酸铵（APS）溶解于超纯蒸馏水中，配制成终浓度为 10 g/mL 的溶液。分装后于 4 °C 保存，用于短期使用（3 周）。
   注意：上述溶液可在水凝胶制备前预先配制。
2. 24 孔板的玻璃活化
   1. 在室温下，向 24 孔玻璃底板（孔径 13 mm，参见材料表）的每孔中加入 500 µL 2 M 氢氧化钠（NaOH），孵育 1 小时。
   2. 用超纯水冲洗各孔 1 次，然后向每孔加入 500 µL 含 2%（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（参见材料表）的 95% 乙醇溶液，作用 5 分钟。
   3. 再次用水冲洗各孔 1 次，向每孔加入 500 µL 0.5% 戊二醛，作用 30 分钟。再用水冲洗各孔 1 次，并在 60 ˚C 下敞盖干燥。
3. 聚丙烯酰胺水凝胶的制备
   注意：参见图 1。
   1. 配制水相溶液，其中含 3–10% 的 40% 储存液丙烯酰胺（参见材料表）和 0.06–0.6% 的 2% 储存液双丙烯酰胺（参见材料表），以制备弹性模量可调（范围为 0.6 kPa 至 70 kPa）的水凝胶。参见表 1。
      1. 对于 0.6 kPa 水凝胶，混合 3% 丙烯酰胺与 0.045% 双丙烯酰胺；对于 3 kPa 水凝胶，混合 5% 丙烯酰胺与 0.074% 双丙烯酰胺；对于 10 kPa 水凝胶，混合 10% 丙烯酰胺与 0.075% 双丙烯酰胺；对于 20 kPa 水凝胶，混合 8% 丙烯酰胺与 0.195% 双丙烯酰胺；对于 70 kPa 水凝胶，混合 10% 丙烯酰胺与 0.45% 双丙烯酰胺。
         注意：有关实现理想聚丙烯酰胺水凝胶刚度的更多细节可参见其他文献。
   2. 为每种目标刚度的水凝胶分别配制两种水相溶液：溶液 1 不含微珠，溶液 2 含 0.03% 直径为 0.1 µm 的荧光微珠（参见材料表）。
   3. 将溶液 1 和溶液 2 置于真空环境中脱气 15 分钟，以去除已知会抑制溶液聚合的氧气。
   4. 向溶液 1 中加入 0.6% 的 10 g/mL 储存液 APS 溶液和 0.43% 四甲基乙二胺（TEMED），以启动聚合反应。操作需迅速。
   5. 将 3.6 µL 溶液 1 加至 24 孔板每孔的中央（其制备方法参见步骤 1.2）。
   6. 立即用 12 mm 未处理的圆形盖玻片覆盖各孔，静置 20 分钟，使溶液 1 完全聚合。
   7. 轻敲注射器针头使其尖端形成微小钩状，以便于移除盖玻片。使用该针头小心提起盖玻片。
   8. 向溶液 2 中加入 0.6% 的 10 g/mL 储存液 APS 溶液和 0.43% TEMED。将 2.4 µL 该混合液加至 24 孔板每孔第一层水凝胶的上方。
   9. 用 12 mm 圆形玻璃盖玻片覆盖溶液 2，使用镊子轻轻向下按压，确保第二层厚度最小。让溶液 2 聚合 20 分钟。
   10. 向每孔加入 500 µL 50 mM、pH 7.5 的 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），然后用注射器针头和镊子移除玻璃盖玻片。
4. 聚丙烯酰胺水凝胶的灭菌、胶原包被与平衡
   1. 在组织培养罩内对水凝胶进行 1 小时的紫外照射，以实现灭菌。
   2. 配制含 0.5%（质量/体积）磺基琥珀酰亚胺基-6-(4′-叠氮-2′-硝基苯氨基)己酸酯（Sulfo-SANPAH，参见材料表）的溶液，溶剂为含 1% 二甲基亚砜（DMSO）的 50 mM HEPES 缓冲液（pH = 7.5）。
   3. 向水凝胶上表面加入 200 µL 该溶液。迅速操作，用紫外光（302 nm）照射 10 分钟以活化水凝胶表面。
   4. 用 1 mL 50 mM HEPES 缓冲液（pH = 7.5）洗涤水凝胶两次。如有需要，可重复洗涤，以确保彻底去除未反应的交联剂。
   5. 用 200 µL 含 0.25 mg/mL 大鼠尾胶原 I（参见材料表）的 50 mM HEPES 缓冲液对水凝胶进行蛋白包被。将胶原溶液覆盖于水凝胶表面后，在室温下孵育过夜。
      注意：为防止脱水或蒸发，应将多孔板置于次级容器中，并在容器内周缘放置浸水的实验室清洁纸巾。
   6. 使用落射荧光或共聚焦显微镜配合 40X 物镜测量水凝胶的厚度。通过确定水凝胶底部（即玻璃表面所在 z 位置）和顶部平面（即荧光微珠信号最强处的 z 位置）的 z 坐标，相减后计算其高度。
      注意：我们使用倒置落射荧光显微镜配合数值孔径为 0.65 的 40X 物镜测量水凝胶厚度。此时也可进行原子力显微镜（AFM）测量，以确认水凝胶的确切刚度（参见图 2）。
   7. 在将目标细胞接种至水凝胶前，向每孔加入 1 mL 培养基，在 37 ˚C 下孵育 30 分钟至 1 小时，以确保充分平衡。
      注意：我们使用 MCDB-131 完全培养基，因为该培养基是模型宿主细胞（HMEC-1）的常规培养体系（详见步骤 2.1）。

2. 人微血管内皮细胞在水凝胶上的培养与接种

1. 在含有MCDB-131完全培养基中培养HMEC-1（人微血管内皮）细胞，该培养基包含添加了10%胎牛血清、10 ng/mL表皮生长因子、1 µg/mL氢化可的松和2 mM L-谷氨酰胺的MCDB-131培养基（参见材料表）。
2. 每3–4天将汇合的细胞以1:6比例传代，并持续培养至第40代。
3. 实验前一天，使用0.25%胰蛋白酶/EDTA将细胞从培养容器中消化下来。首先用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞及其培养容器1次，然后加入适量0.25%胰蛋白酶/EDTA（每100 mm培养皿或75 cm²培养瓶加2 mL，每60 mm培养皿或25 cm²培养瓶加1 mL），于37 °C孵育5–10分钟，使细胞从基质上脱落。
4. 加入所需体积的MCDB-131完全培养基以中和胰蛋白酶，轻轻吹打混匀以分散细胞团块，随后将细胞悬液转移至锥形离心管中。
5. 轻轻晃动细胞悬液以确保细胞均匀分布，取20 µL悬液，极其轻柔地将盖玻片下方血细胞计数板的两个计数室充满。
6. 将含有细胞悬液的锥形离心管在500 × g条件下离心10分钟，使细胞沉淀。
7. 在离心等待的10分钟内，使用血细胞计数板进行细胞计数。在显微镜下用10倍物镜对准血细胞计数板的网格线，用手持计数器统计其中一个1 mm × 1 mm方格内的细胞数量。
8. 将血细胞计数板移至另一个1 mm × 1 mm方格，计数该区域细胞，并重复此过程再进行两次。计算四次计数的平均值，再将该平均值乘以10⁴，所得结果即为正在离心的细胞悬液中每毫升的活细胞数。
9. 小心吸除锥形离心管中的上清液，避免扰动细胞沉淀。将细胞重悬于MCDB-131完全培养基中，调整细胞浓度至4 × 10⁵ 个细胞/mL。
10. 将细胞悬液接种到水凝胶上：首先移除水凝胶中孵育用的培养基，然后在每块水凝胶上加入1 mL细胞悬液。

3. 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）感染人微血管内皮细胞

1. 提前准备
   注意：提前配制以下溶液。
   1. 链霉素、氯霉素和庆大霉素储备液
      1. 通过称取0.5 g硫酸链霉素并完全溶解于10 mL超纯水中，配制50 mg/mL的链霉素储备液。
      2. 通过称取75 mg氯霉素并完全溶解于10 mL 100%乙醇中，配制7.5 mg/mL氯霉素储存液。
      3. 称取0.2 g硫酸庆大霉素，溶于10 mL超纯水中，充分溶解，配制成20 mg/mL的庆大霉素储备液。
      4. 使用0.2 µm针头滤器对所有储备液进行过滤除菌，并于-20 °C保存以长期使用（1–2个月）。
   2. 脑心浸液（BHI）培养基和琼脂平板
      1. 找到两个1-L的烧瓶，并在每个烧瓶中放入一个磁力搅拌子。
      2. 在BHI培养基中，将37 g BHI粉末加入一个烧瓶中，并加入超纯水至1 L。将烧瓶置于磁力搅拌器上，剧烈搅拌溶液直至粉末完全溶解。
      3. 对于BHI琼脂平板，加入37 g BHI粉末和15 g颗粒状琼脂（参见 材料表在第二个烧瓶中加入超纯水至1 L。将烧瓶置于磁力搅拌器上，剧烈搅拌溶液，直至粉末完全溶解。
      4. 锥形瓶瓶盖不要拧得过紧，使用液体程序或按照灭菌锅的说明对溶液进行高压灭菌。
      5. 从高压灭菌器中取出溶液，然后将琼脂-BHI 溶液冷却至 55 °C。如果 1 L 三角瓶中的 BHI 培养基保持无菌，可保存使用长达一个月。
      6. 制备细菌培养用BHI琼脂平板时，首先根据拟培养的细菌菌株，在含有BHI和琼脂的锥形瓶中加入适当的抗生素。随后将锥形瓶短暂置于磁力搅拌器上，以促进快速混匀。
         注意此处使用的抗生素针对所用的单核细胞增生李斯特菌（Lm）菌株，但可根据需要在BHI琼脂平板中使用其他适当的抗生素。我们添加链霉素至终浓度为200 µg/mL，氯霉素至终浓度为7.5 µg/mL，因为10403S Lm菌株对链霉素具有抗性。这些菌株已通过接合方式携带含有氯霉素乙酰转移酶开放阅读框的质粒，因此对氯霉素也具有抗性。
      7. 将混合物倒入10 cm聚苯乙烯细菌培养皿中（每皿约20 mL）。为去除气泡，短暂灼烧培养皿表面。室温下冷却过夜。
      8. 第二天，将干燥的平板密封，并于 4 °C 保存。
2. 人微血管内皮细胞感染 L. monocytogenes
   1. 感染前3天，根据需要从-80 °C保存的甘油菌种中划线接种待用的Lm菌株至含7.5 µg/mL氯霉素和200 µg/mL链霉素的BHI琼脂平板。
      注意待划线的菌株可以是野生型或突变型，可组成型表达荧光（免疫染色使用JAT1045），或在ActA启动子下表达荧光（流式细胞术或牵引力显微镜实验使用JAT983或JAT985）。
   2. 将培养皿置于37 °C培养，直至形成单个菌落（1 - 2天）。
   3. 感染前一天，将目标菌株接种于含7.5 µg/mL氯霉素（如适用）的BHI培养基中，30 °C、150 rpm振荡培养过夜。
      1. 将5 mL BHI培养基加入15 mL圆锥形离心管中，加入7.5 µg/mL氯霉素（如适用），然后使用无菌10 µL枪头从琼脂平板接种单个菌落。
   4. 第二天，在感染前，取样品以1:5比例稀释后，使用BHI培养基作为空白对照，在600 nm处测定细菌溶液的光密度（OD600）。
   5. 将过夜培养物稀释至OD600为0.1，加入含7.5 µg/mL氯霉素（如适用）的BHI培养基中，于30 °C振荡培养2 h，使细菌进入对数生长期。
   6. 测量菌液的OD600，预期值约为0.2–0.3。若OD600高于此范围，用BHI单独稀释至0.2–0.3。
   7. 取1 mL细菌溶液至微量离心管中，在室温下以2,000 × g离心4分钟。弃去上清液，在组织培养超净台中将细菌沉淀重悬于1 mL组织培养级PBS中。在室温下以2,000 × g再次离心4分钟，重复此洗涤步骤两次。每次均弃去上清液，并将细菌沉淀重悬于1 mL PBS中。
   8. 通过将10或50 µL用PBS重悬的细菌与1 mL MCDB-131完全培养基混合，制备感染混合物，以获得感染复数（MOI； 即每个宿主细胞内的细菌数量（即每个宿主细胞的细菌数）约为50个或10个。
   9. 从24孔板的各孔中移除培养基，注意不要破坏水凝胶或细胞。用1 mL MCDB-131完全培养基将细胞洗涤1次，然后向每孔加入1 mL细菌悬液。
   10. 保留部分感染液（至少100 µL），用于测定MOI（参见 步骤 3.3).
   11. 用培养皿盖盖好培养皿，并用聚乙烯食品保鲜膜包裹培养皿以防止泄漏。将培养皿放入离心机，于200 × g离心10分钟，以同步化侵袭过程。随后将培养皿转移至组织培养孵箱中，在37 °C条件下孵育30分钟。
   12. 用完全 MCDB-131 培养基洗涤样本 4 次，并将其转移至组织培养孵箱中。再孵育 30 分钟后，更换为添加了 20 µg/mL 庆大霉素的培养基。
3. 感染复数（MOI）的测定
   1. 在宿主细胞与细菌初始孵育的前30分钟内，对感染混合物进行10倍系列稀释以确定感染复数（MOI）。通过将100 µL感染混合物与900 µL 1x PBS混合制备10倍稀释液（10⁻¹），依次进行后续稀释。^-1 稀释）。然后，取100 µL的10⁻¹稀释液与100 µL的10⁻²稀释液混合^-1 用900 µL PBS稀释（10^-2 稀释）
   2. 继续操作直至完成10^-5 获得稀释液。
      注意：所有溶液在稀释前均需充分混匀，且每一步骤均应使用新鲜洁净的移液器吸头。
   3. 稀释完成后，取100 µL的10⁻¹稀释液^-2 - 10^-5 在BHI/琼脂/氯霉素/链霉素平板中央进行稀释（如适用）。
   4. 使用火焰将玻璃移液管弯曲成钩状，制成涂布棒。将移液管浸入100%乙醇中进行消毒，随后用火焰烧尽乙醇。
   5. 待涂布棒冷却后，从10开始，将细菌稀释液均匀涂布于平板上^-5 稀释并转移至浓度更高的混合液中。将培养皿倒置，在37 °C下孵育2天。
   6. 根据菌落密度，确定10倍稀释梯度中菌落数量^-3 和 10^-4 或 10^-4 和10^-5 稀释平板。按如下方法计算MOI：
      菌落数 × 稀释倍数 ÷ 初始加入体积 = 每微升菌落形成单位（CFU/µL）
      每微升菌落形成单位数 × 每孔细菌混合液体积 = 每孔菌落形成单位数
      每孔菌落形成单位数 × 每孔细胞体积 = 每细胞细菌数
      注意CFU 是菌落形成单位的缩写。
   7. 取两块培养板的平均感染复数（MOI）以获得最终的MOI值。

4. 定量延时显微镜评估细胞外基质刚度

在24孔板上制备PA水凝胶（见步骤1），接种HMEC-1细胞（见步骤2），并按照上述方法培养JAT983菌液过夜（见步骤3）。

1. 感染当天，通过将每毫升 MCDB-131 完全培养基中加入 10 µL 细菌沉淀来制备感染混合物。小心移除 24 孔板各孔中的培养基，然后向每孔加入 1.9 mL MCDB-131 完全培养基和 0.1 mL 细菌混合物。
   注意：本实验中使用的较低感染复数（MOI）对于分析从单个细菌侵入宿主细胞开始的扩散事件是必要的。
2. 用盖子盖好培养板，并用塑料封口膜密封以防止泄漏。将培养板放入离心机中，在 200 × g 条件下离心 10 分钟，以同步细菌侵入过程。
3. 将培养板转移至组织培养孵箱中，孵育 5 分钟。
4. 用培养基洗涤样品 4 次，然后将其转移至组织培养孵箱中。再孵育 5–7 分钟后，更换为含有 20 µg/mL 庆大霉素的培养基。
5. 将培养板继续在孵箱中孵育额外 5 小时，以使 actA 启动子激活并驱动 mTagRFP 开放阅读框的表达。
6. 通过在 Leibovitz's L-15 培养基中添加 10% 胎牛血清、10 ng/mL 表皮生长因子和 1 µg/mL 氢化可的松来制备活细胞显微镜成像培养基。
   注意：L-15 培养基已含有 2 mM L-谷氨酰胺，因此无需像 MCDB-131 培养基那样额外添加。
7. 将 1 μL 的 1 mg/mL Hoechst 染料与 1 mL L-15 完全培养基混合，并加入每孔以染色细胞核。将细胞在组织培养孵箱中孵育 10 分钟，然后将每孔中的 L-15 完全培养基更换为 1 mL 含有 20 µg/mL 庆大霉素的 L-15 完全培养基。用盖子盖好培养板，并将其置于已平衡至 37 ˚C 的显微镜环境培养室中（见材料表）。
   注意：成像时使用了配备 CCD 相机（见材料表）和 20X 空气平场萤石物镜（数值孔径 0.75）的倒置落射荧光显微镜。光源功率设置为 50%，曝光时间为 50 ms。用于 mCherry 的显微镜滤光片激发波长和发射波长分别为 470/525 nm。
8. 利用自动对焦功能，每隔 5 分钟对多个视野进行成像，以监测单核细胞增生李斯特菌（Lm）在不同刚度水凝胶上接种的 HMEC-1 单层细胞中的扩散情况。
   注意：L-15 培养基使用 HEPES 缓冲体系，因此成像过程中无需使用 CO₂。

表1. 不同硬度的聚丙烯酰胺（PA）水凝胶的组成。 本表列出了为达到特定硬度（杨氏模量，E）所需的40%丙烯酰胺母液的百分比以及2%双丙烯酰胺母液的百分比，分别显示在不同列中。

杨氏模量（E，kPa）	丙烯酰胺%（来自40%储存液）	双丙烯酰胺%（来自2%储存液）
0.6	3	0.045
3	5	0.075
10	10	0.075
20	8	0.195
70	10	0.45

结果

图1：在不同硬度的含荧光微珠双层聚丙烯酰胺（PA）水凝胶上生长的宿主细胞的细菌感染检测。A. 对玻璃盖玻片进行化学修饰以实现水凝胶的附着。B. 在玻璃底面滴加3.6 µL的PA混合液。C. 用12 mm圆形玻璃盖玻片覆盖混合液以促进聚合。D. 使用针头注射器移除盖玻片。E. 在底层上方加入2.4 µL含微珠的PA溶液，并加盖圆形玻璃盖玻片。F. 向孔中加入缓冲液，然后移除盖玻片。G. 紫外线照射1小时以确保灭菌。H

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
氢氧化钠颗粒	Fisher	S318-500
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma	A3648
25% 戊二醛	Sigma	G6257-100ML
40% 丙烯酰胺	Sigma	A4058-100ML
双丙烯酰胺溶液 (2% w/v)	Fisher Scientific	BP1404-250
过硫酸铵	Fisher	BP17925
TEMED	Sigma	T9281-25ML
Sulfo-SANPAH	Proteochem	c1111-100mg
大鼠I型胶原溶液	Sigma	C3867-1VL
二甲基亚砜 (DMSO)	J.T. Baker	9224-01
HEPES，游离酸	J.T. Baker	4018-04
Leibovitz L-15 培养基，无酚红	Thermofischer	21083027
MCDB 131 培养基，无谷氨酰胺	Life technologies	10372019
基础胎牛血清，批号：A37C48A	Gemini Bio-Prod	900108 500ml
表皮生长因子，EGF	Sigma	E9644
氢化可的松	Sigma	H0888
L-谷氨酰胺 200 mM	Fisher	SH3003401
DPBS 1X	Fisher	SH30028FS
硫酸庆大霉素	MP biomedicals	194530
氯霉素	Sigma	C0378-5G
Difco™ 琼脂，颗粒状	BD	214530
BBL™ 脑心浸液	BD	211059
Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物 — 水中 10 mg/μl 溶液	Invitrogen	H3570
0.25% 胰蛋白酶-EDTA，含酚红	Thermofischer	25200056
硫酸链霉素	Fisher Scientific	3810-74-0
一次性实验器材
12 mm 圆形玻璃盖玻片	Fisherbrand	12-545-81	No. 1.5 盖玻片 | 10 mm 玻璃直径 | 未包被
玻璃底 24 孔板	Mattek	P24G-1.5-13-F
T-25 培养瓶	Falcon	353118
50 ml 锥形管	Falcon	352070
15 ml 锥形管	Falcon	352196
一次性移液管 (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)	Falcon	357551
巴斯德玻璃移液管	VWR	14672-380
移液器吸头 (1–200 μl, 101–1000 μl)	Denville	P1122, P1126
无粉检查手套	Microflex	XC-310
细菌比色皿	Sarstedt	67.746
剃刀	VWR	55411-050
注射器针头	BD	305167
0.2 μm 灭菌瓶	Thermo Scientific	566-0020
20 ml 注射器	BD	302830
0.2 μm 滤器	Thermo Scientific	723-2520
木棒	Grainger	42181501
保鲜膜	Santa Cruz Biotechnologies	sc-3687
细菌培养皿	Falcon	351029
大型/非一次性实验设备
组织培养罩	Baker	SG504
血细胞计数板	Sigma	Z359629
细菌培养箱	Thermo Scientific	IGS180
组织培养箱	NuAire	NU-8700
真空室/脱气装置	Belart	42025	37 °C 和 5% CO2
尼康 Diaphot 200 倒置落射荧光显微镜	Nikon	NIKON-DIAPHOT-200
笼式培养箱	Haison	Custom
移液器辅助器	Drummond	4-000-110
移液器 (10 μl, 200 μl, 1000 μl)	Gilson	F144802, F123601, F123602
pH 计	Mettler Toledo	30019028
镊子	FST	11000-12
1 L 烧瓶	Fisherbrand	FB5011000
高压灭菌器	Amsco	3021
磁力搅拌器	Bellco	7760-06000
磁力搅拌子	Bellco	1975-00100
分光光度计	Beckman	DU 640
软件
显微镜软件 (μManager)	Open Imaging
Matlab	Matlab Inc
Flowjo	FlowJo, LLC
自动化图像分析软件 CellC	https://sites.google.com/site/cellcsoftware/		该软件可免费获取。可执行文件和 MATLAB 源代码可在 https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ 下载