定量延时显微镜技术用于评估细胞外基质刚度依赖性细菌扩散

摘要

来源：Bastounis, E. E. 等，一种基于多孔聚丙烯酰胺的实验方法，用于研究细胞外基质刚度对黏附细胞细菌感染的影响。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了用于评估细胞外基质刚度依赖性的定量延时显微镜技术 单核细胞增生李斯特菌 通过内皮细胞的播散。与较硬的水凝胶相比，较软的水凝胶可促进细菌更快地通过内皮细胞播散，凸显了基质刚度对细菌播散的影响。

方案

1. 在多孔板上制备薄双层聚丙烯酰胺（PA）水凝胶

1. 将过硫酸铵（APS）溶解于超纯蒸馏水中，配制成终浓度为 10 g/mL 的溶液。分装后于 4 °C 保存，用于短期使用（3 周）。
   注意：上述溶液可在水凝胶制备前预先配制。
2. 24 孔板的玻璃活化
   1. 在室温下，向 24 孔玻璃底板（孔径 13 mm，参见材料表）的每孔中加入 500 µL 2 M 氢氧化钠（NaOH），孵育 1 小时。
   2. 用超纯水冲洗各孔 1 次，然后向每孔加入 500 µL 含 2%（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（参见材料表）的 95% 乙醇溶液，作用 5 分钟。
   3. 再次用水冲洗各孔 1 次，向每孔加入 500 µL 0.5% 戊二醛，作用 30 分钟。再用水冲洗各孔 1 次，并在 60 ˚C 下敞盖干燥。
3. 聚丙烯酰胺水凝胶的制备
   注意：参见图 1。
   1. 配制水相溶液，其中含 3–10% 的 40% 储存液丙烯酰胺（参见材料表）和 0.06–0.6% 的 2% 储存液双丙烯酰胺（参见材料表），以制备弹....

结果

图1：在不同硬度的含荧光微珠双层聚丙烯酰胺（PA）水凝胶上生长的宿主细胞的细菌感染检测。A. 对玻璃盖玻片进行化学修饰以实现水凝胶的附着。B. 在玻璃底面滴加3.6 µL的PA混合液。C. 用12 mm圆形玻璃盖玻片覆盖混合液以促进聚合。D. 使用针头注射器移除盖玻片。E. 在底层上方加入2.4 µL含微珠的PA溶液，并加盖圆形玻璃盖玻片。F. 向孔中加入缓冲液，然后移除盖玻片。G. 紫外线照射1小时以确保灭菌。H

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
氢氧化钠颗粒	Fisher	S318-500
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Sigma	A3648
25% 戊二醛	Sigma	G6257-100ML
40% 丙烯酰胺	Sigma	A4058-100ML
双丙烯酰胺溶液 (2% w/v)	Fisher Scientific	BP1404-250
过硫酸铵	Fisher	BP17925
TEMED	Sigma	T9281-25ML
Sulfo-SANPAH	Proteochem	c1111-100mg
大鼠I型胶原溶液	Sigma	C3867-1VL
二甲基亚砜 (DMSO)	J.T. Baker	9224-01
HEPES，游离酸	J.T. Baker	4018-04
Leibovitz L-15 培养基，无酚红	Thermofischer	21083027
MCDB 131 培养基，无谷氨酰胺	Life technologies	10372019
基础胎牛血清，批号：A37C48A	Gemini Bio-Prod	900108 500ml
表皮生长因子，EGF	Sigma	E9644
氢化可的松	Sigma	H0888
L-谷氨酰胺 200 mM	Fisher	SH3003401
DPBS 1X	Fisher	SH30028FS
硫酸庆大霉素	MP biomedicals	194530
氯霉素	Sigma	C0378-5G
Difco™ 琼脂，颗粒状	BD	214530
BBL™ 脑心浸液	BD	211059
Hoechst 33342，三盐酸盐，三水合物 — 水中 10 mg/μl 溶液	Invitrogen	H3570
0.25% 胰蛋白酶-EDTA，含酚红	Thermofischer	25200056
硫酸链霉素	Fisher Scientific	3810-74-0
一次性实验器材
12 mm 圆形玻璃盖玻片	Fisherbrand	12-545-81	No. 1.5 盖玻片 | 10 mm 玻璃直径 | 未包被
玻璃底 24 孔板	Mattek	P24G-1.5-13-F
T-25 培养瓶	Falcon	353118
50 ml 锥形管	Falcon	352070
15 ml 锥形管	Falcon	352196
一次性移液管 (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)	Falcon	357551
巴斯德玻璃移液管	VWR	14672-380
移液器吸头 (1–200 μl, 101–1000 μl)	Denville	P1122, P1126
无粉检查手套	Microflex	XC-310
细菌比色皿	Sarstedt	67.746
剃刀	VWR	55411-050
注射器针头	BD	305167
0.2 μm 灭菌瓶	Thermo Scientific	566-0020
20 ml 注射器	BD	302830
0.2 μm 滤器	Thermo Scientific	723-2520
木棒	Grainger	42181501
保鲜膜	Santa Cruz Biotechnologies	sc-3687
细菌培养皿	Falcon	351029
大型/非一次性实验设备
组织培养罩	Baker	SG504
血细胞计数板	Sigma	Z359629
细菌培养箱	Thermo Scientific	IGS180
组织培养箱	NuAire	NU-8700
真空室/脱气装置	Belart	42025	37 °C 和 5% CO2
尼康 Diaphot 200 倒置落射荧光显微镜	Nikon	NIKON-DIAPHOT-200
笼式培养箱	Haison	Custom
移液器辅助器	Drummond	4-000-110
移液器 (10 μl, 200 μl, 1000 μl)	Gilson	F144802, F123601, F123602
pH 计	Mettler Toledo	30019028
镊子	FST	11000-12
1 L 烧瓶	Fisherbrand	FB5011000
高压灭菌器	Amsco	3021
磁力搅拌器	Bellco	7760-06000
磁力搅拌子	Bellco	1975-00100
分光光度计	Beckman	DU 640
软件
显微镜软件 (μManager)	Open Imaging
Matlab	Matlab Inc
Flowjo	FlowJo, LLC
自动化图像分析软件 CellC	https://sites.google.com/site/cellcsoftware/		该软件可免费获取。可执行文件和 MATLAB 源代码可在 https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ 下载