用于评估细胞外基质刚度依赖性细菌传播的定量延时显微镜

Abstract

来源:Bastounis， E. E. et al.， 一种基于多孔格式聚丙烯酰胺的测定法，用于研究细胞外基质刚度对贴壁细胞细菌感染的影响。J. Vis. Exp.（2018 年）

该视频展示了用于评估细胞外基质刚度依赖性单核细胞增生李斯特菌通过内皮细胞传播的定量延时显微镜。与较硬的水凝胶相比，较软的水凝胶有助于细菌通过内皮细胞更快地传播，突出了基质刚度对细菌传播的影响。

Protocol

1. 在多孔板上制造薄的双层聚丙烯酰胺 （PA） 水凝胶

将
1. 过硫酸铵 （APS） 溶解在蒸馏超纯水中，使最终浓度达到 10 g/mL。将溶液分装并储存在 4 °C 下以供短期使用（3 周）。
   注:上述溶液可以在水凝胶制造之前制备。
2. 24 孔培养皿的玻璃活化
   1. 在室温下，将 24 孔玻璃底板与 13 mm 直径的孔（参见材料表）与 500 μL 2 M 氢氧化钠 （NaOH） 一起孵育 1 小时。
   2. 用超纯水冲洗孔 1 次，然后向每个孔中加入 500 μL 2%（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（参见材料表）的 95% 乙醇溶液 5 分钟。
   3. 再次用水冲洗孔 1 次，并向每个孔中加入 500 μL 0.5% 戊二醛 30 分钟。用水冲洗孔 1 次，并在 60 °C 下盖上盖子干燥。
3. 聚丙烯酰胺水凝胶制造
   注意:参见图 1。
   1. 制备含有 3 - 10% 的 40% 丙烯酰胺原液（见材料表）和 0.06 - 0.6% 的 2% 双丙烯酰胺原液（见材料表）的水溶液，以制造具有可调....

Results

图 1:驻留在不同刚度的薄双层荧光珠包埋聚丙烯酰胺 （PA） 水凝胶上的宿主细胞的细菌感染测定。答。玻璃盖玻片经过化学改性，可实现水凝胶附着。湾。将 3.6 μL 的 PA 混合物沉积在玻璃底部。混合物用 12 毫米圆形玻璃盖玻片覆盖，以便进行聚合。D.用针头注射器取出盖玻片。E.在底层顶部加入 2.4 μL 含微珠的 PA 溶液，并用圆形玻璃盖玻片盖上。在孔中加入缓冲液并去除盖玻片。 G.紫外线照射 1 小时确保灭菌。H.在凝胶上加入含 Sulfo-SANPAH 的溶液，然后将其置于紫外线下 10 分钟。用水缓冲液洗涤水凝胶，然后与胶原.......

Materials