用于评估细胞外基质刚度依赖性细菌传播的定量延时显微镜

摘要

来源:Bastounis， E. E. et al.， 一种基于多孔格式聚丙烯酰胺的测定法，用于研究细胞外基质刚度对贴壁细胞细菌感染的影响。J. Vis. Exp.（2018 年）

该视频展示了用于评估细胞外基质刚度依赖性单核细胞增生李斯特菌通过内皮细胞传播的定量延时显微镜。与较硬的水凝胶相比，较软的水凝胶有助于细菌通过内皮细胞更快地传播，突出了基质刚度对细菌传播的影响。

方案

1. 在多孔板上制造薄的双层聚丙烯酰胺 （PA） 水凝胶

将
1. 过硫酸铵 （APS） 溶解在蒸馏超纯水中，使最终浓度达到 10 g/mL。将溶液分装并储存在 4 °C 下以供短期使用（3 周）。
   注:上述溶液可以在水凝胶制造之前制备。
2. 24 孔培养皿的玻璃活化
   1. 在室温下，将 24 孔玻璃底板与 13 mm 直径的孔（参见材料表）与 500 μL 2 M 氢氧化钠 （NaOH） 一起孵育 1 小时。
   2. 用超纯水冲洗孔 1 次，然后向每个孔中加入 500 μL 2%（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（参见材料表）的 95% 乙醇溶液 5 分钟。
   3. 再次用水冲洗孔 1 次，并向每个孔中加入 500 μL 0.5% 戊二醛 30 分钟。用水冲洗孔 1 次，并在 60 °C 下盖上盖子干燥。
3. 聚丙烯酰胺水凝胶制造
   注意:参见图 1。
   1. 制备含有 3 - 10% 的 40% 丙烯酰胺原液（见材料表）和 0.06 - 0.6% 的 2% 双丙烯酰胺原液（见材料表）的水溶液，以制造具有可调刚度范围为 0.6 kPa 至 70 kPa 的水凝胶。请参阅 表 1。
      1. 对于 0.6 kPa 水凝胶，将 3% 丙烯酰胺与 0.045% 双丙烯酰胺混合。对于 3 kPa 水凝胶，将 5% 丙烯酰胺与 0.074% 双丙烯酰胺混合。对于 10 kPa 水凝胶，将 10% 丙烯酰胺与 0.075% 双丙烯酰胺混合。对于 20 kPa 水凝胶，将 8% 丙烯酰胺与 0.195% 双丙烯酰胺混合。对于 70 kPa 水凝胶，将 10% 丙烯酰胺与 0.45% 双丙烯酰胺混合。
         注:有关实现所需 PA 水凝胶刚度的更多详细信息，请参见其他位置。
   2. 为每种所需的水凝胶刚度准备两种水溶液。准备无珠溶液 1，制备含有 0.03% 0.1 μm 直径荧光微珠的溶液 2（参见材料表）。
   3. 通过真空对溶液 1 和 2 进行 15 分钟的脱气，以去除已知会抑制溶液聚合的氧气。
   4. 向溶液 1 中加入 0.6% 的 10 g/mL APS 储备液和 0.43% 四甲基乙二胺 （TEMED） 以引发聚合。快速行动。
   5. 将 3.6 μL 溶液 1 添加到 24 孔培养皿的每个孔的中心（其制备参见步骤 1.2）。
   6. 立即用 12 mm 未处理的圆形盖玻片覆盖孔，让溶液 1 静置 20 分钟，使其完全聚合。
   7. 轻轻地将注射器针头敲击到表面，在其尖端形成一个小钩子，以方便取下盖玻片。使用注射器针头提起盖玻片。
   8. 向溶液 2 中加入 0.6% 的 10 g/mL APS 储备液和 0.43% TEMED。将 2.4 μL 混合物沉积在 24 孔培养皿的每个孔中的第一层顶部。
   9. 用 12 毫米圆形玻璃盖玻片盖住解决方案 2，用一对镊子轻轻向下按压，以确保第二层的厚度最小。让溶液 2 聚合 20 分钟。
   10. 向每个孔中加入 500 μL 50 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES） pH 7.5，然后用注射器针头和镊子取下玻璃盖玻片。
4. 聚丙烯酰胺水凝胶的灭菌、胶原涂层和平衡
   将
   1. 水凝胶在组织培养罩中紫外线照射 1 小时以进行灭菌。
   2. 在 1% 二甲基亚砜 （DMSO） 和 50 mM HEPES pH = 7.5 中制备 0.5% 重量/体积的磺基琥珀酰亚胺基 6-（4′-叠氮基-2′-硝基苯氨基）己酸酯（Sulfo-SANPAH，参见材料表）的混合物。
   3. 将 200 μL 此溶液添加到水凝胶的上表面。快速作用，将它们暴露在紫外线 （302 nm） 下 10 分钟以激活它们。
   4. 用 1 mL 的 50 mM HEPES pH = 7.5 洗涤水凝胶两次。如果需要，重复以确保去除任何多余的交联剂。
   5. 在 50 mM HEPES 中用 200 μL 0.25 mg/mL 大鼠尾胶原 I（参见材料表）包被水凝胶。将水凝胶，胶原蛋白溶液放在上面，在室温下孵育过夜><。 注:为防止脱水/蒸发，请将多孔板置于二级密封层中，并在密封层的内外围添加浸泡在水中的实验室清洁纸。
   6. 使用具有 40 倍物镜的落射荧光或共聚焦显微镜测量水凝胶的厚度。通过定位水凝胶的底部（玻璃表面所在的位置）和顶部平面（荧光珠的强度最大）的 z 位置来实现。然后减去 z 位置以确定高度。
      注意:我们使用倒置落射荧光显微镜和数值孔径为 0.65 的 40 倍物镜来测量水凝胶的厚度。此时也可以进行原子力显微镜 （AFM） 测量，以确认水凝胶的确切刚度（见图 2）。
   7. 在将感兴趣的细胞接种到水凝胶上之前，在水凝胶上加入 1 mL 培养基，并在 37 °C 下孵育 30 分钟至 1 小时以确保平衡><。 注:我们添加了 MCDB-131 完全培养基，因为这是培养模型宿主细胞 （HMEC-1） 的培养基（有关详细信息，请参阅步骤 2.1）。

2. 人微血管内皮细胞培养和水凝胶接种

1. 在含有补充有 10% 胎牛血清、10 ng/mL 表皮生长因子、1 μg/mL 氢化可的松和 2 mM L-谷氨酰胺的 MCDB-131 培养基的 MCDB-131 全培养基中培养 HMEC-1（人、微血管内皮）细胞（参见材料表）。
2. 每 3-4 天以 1:6 的比例分流汇合培养物，并保留细胞直至第 40 次传代。
3. 实验前一天，使用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 将细胞从培养容器中分离。首先，用无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞及其培养容器 1 次，然后加入适量的 0.25% 胰蛋白酶/EDTA（每 100 mm 培养皿或 75 cm 培养瓶 2 mL，每 60 mm 培养皿或 25 cm 培养瓶 1 mL），在 37 °C 下孵育培养瓶 5 - 10 分钟，以使细胞从其底物上分离。
4. 通过添加所需体积的 MCDB-131 全培养基来中和胰蛋白酶，轻轻吸取以打碎细胞团块，然后将溶液放入锥形离心管中。
5. 轻轻旋转细胞溶液以确保细胞均匀分布，然后取出 20 μL 溶液，非常轻轻地填充玻璃血细胞计数器盖玻片下方的两个腔室。
6. 以 500 x g 的离心力离心 10 分钟，沉淀锥形离心管中包含的细胞溶液。
7. 在 10 分钟的等待期内，使用血细胞计数器对细胞进行计数。使用显微镜，用 10 倍物镜聚焦血细胞计数器的网格线，然后使用手动计数计数器计数一个 1 mm x 1 mm 正方形中的细胞数。
8. 将血细胞计数器移至另一个 1 mm x 1 mm 的正方形，在那里计数细胞，然后再重复该过程两次。计算四个测量值的平均值，然后将平均值乘以 10⁴。最终值是被离心的细胞悬液中/mL 的活细胞数。
9. 从锥形离心管中取出液体，同时确保细胞沉淀未被破坏。将细胞重悬于 MCDB-131 完全培养基中，浓度为 4 x 10⁵ 个细胞/mL。
10. 首先去除与水凝胶一起孵育的培养基，然后在每个水凝胶上加入 1 mL 细胞悬液，将悬浮细胞接种在水凝胶上。

3. 人微血管内皮细胞与单核细胞增生李斯特菌的感染 （Lm）

1. 提前准备
   注意:请提前准备以下解决方案。
   1. 链霉素、氯霉素和庆大霉素原液
      1. 称取 0.5 g 硫酸链霉素并将其完全溶解到 10 mL 超纯水中，制备 50 mg/mL 链霉素储备液。
      2. 称取 75 mg 氯霉素并将其完全溶解到 10 mL 100% 乙醇中，制备 7.5 mg/mL 氯霉素储备液。
      3. 称取 0.2 g 硫酸庆大霉素并将其完全溶解到 10 mL 超纯水中，制备 20 mg/mL 庆大霉素储备液。
      4. 用 0.2 μm 针式过滤器对所有储备溶液进行过滤灭菌，并将其储存在 -20 °C 以供长期使用（1 - 2 个月）。
   2. 脑心输液 （BHI） 培养基和琼脂平板
      1. 找到两个 1 L 培养瓶，并在每个培养瓶内添加一个磁性搅拌棒。
      2. 对于 BHI 培养基，在一个培养瓶中加入 37 g BHI 粉末，并加入至 1 L 的超纯水。将培养瓶放在磁力搅拌板上，充分混合溶液，直至粉末溶解。
      3. 对于 BHI 琼脂平板，在第二个培养瓶中加入 37 g BHI 粉末和 15 g 颗粒状琼脂（参见材料表），并加入至 1 L 的超纯水。将培养瓶放在磁力搅拌板上，充分混合溶液，直到粉末溶解。
      4. 不要太紧地拧上培养瓶的盖子，并使用液体设置或根据高压灭菌器的规格对溶液进行高压灭菌。
      5. 从高压灭菌器中取出溶液，然后将琼脂-BHI 溶液冷却至 55 °C。如果 1 L 培养瓶中的 BHI 培养基保持无菌状态，则可使用长达一个月。
      6. 为了制备细菌琼脂-BHI 板，首先在含有 BHI 和琼脂的培养瓶中加入抗生素（如果合适）（取决于要培养的细菌菌株）。将烧瓶短暂地放在磁力搅拌板上，以便快速混合。
         注意:此处使用的抗生素对所使用的 Lm 菌株具有特异性，但任何必要的抗生素都可以在 BHI 琼脂平板中使用。我们添加了浓度为 200 μg/mL 的链霉素和浓度为 7.5 μg/mL 的氯霉素，因为 10403S Lm 菌株对链霉素具有耐药性。这些菌株与含有氯霉素乙酰转移酶开放阅读框的质粒偶联，因此对氯霉素具有抗性。
      7. 将混合物倒入 10 cm 聚苯乙烯细菌培养板中（每板约 20 mL）。为了去除气泡，请短暂地燃烧板的上表面。在室温下冷却板过夜。
      8. 第二天，密封干燥板并储存在 4 °C。
2. 人微血管内皮细胞与单核细胞增生李斯特菌的感染
   1. 感染前三天，将要使用的 Lm 菌株从甘油原液（储存在 -80 °C）中划线到含有 7.5 μg/mL 氯霉素和 200 μg/mL 链霉素的 BHI 琼脂平板上，如果合适><。 注:要划线的菌株可以是野生型或突变型，组成型表达荧光（用于免疫染色JAT1045使用）或在 ActA 启动子下表达荧光（用于流式细胞术或牵引力显微镜使用 JAT983 或 JAT985）。
   2. 在 37 °C 下孵育板，直到形成离散的菌落（1 - 2 天）。
   3. 感染前一天，将所需的菌株培养过夜，在 30 °C 下在 BHI 培养基中以 150 rpm 摇动，加入 7.5 μg/mL 氯霉素（如果合适）。
      1. 将 5 mL BHI 培养基放入 15 mL 锥形离心管中，加入 7.5 μg/mL 氯霉素（如果合适），然后使用无菌 10 μL 吸头从琼脂平板上接种单个菌落。
   4. 第二天，就在感染之前，通过以 1:5 的比例稀释样品，测量细菌溶液在 600 nm 处的光密度 （OD 600 ）;使用单独含有 BHI 的比色皿作为空白。
   5. 将过夜培养物稀释至 OD 600 为 0.1，并在 BHI 培养基中用 7.5 μg/mL 氯霉素（如果合适）孵育，在 30 °C 下振荡 2 小时，以使细菌达到对数期生长。
   6. 测量细菌溶液的 OD 600 ，预计约为 0.2-0.3。如果 OD600 更高，则单独使用 BHI 将其稀释至 0.2 - 0.3。
   7. 将 1 mL 细菌溶液放入微量离心管中。在室温下离心，以 2,000 x g 的速度离心 4 分钟。去除上清液，将细菌沉淀重悬于组织培养罩中的 1 mL 组织培养级 PBS 中。通过在室温下以 2,000 x g 旋转 4 分钟，再洗涤细菌两次。去除上清液并将细菌重悬于 1 mL PBS 中。
   8. 通过将 10 或 50 μL 重悬于 PBS 中的细菌与 1 mL MCDB-131 全培养基混合来制备感染混合物，以实现感染的多样性 （MOI;即每个宿主细胞的细菌数），每个宿主细胞大约 50 个细菌或每个宿主细胞 10 个细菌。
   9. 从 24 孔板的孔中取出培养基，小心不要破坏水凝胶或细胞。用 1 mL 的 MCDB-131 全培养基洗涤细胞 1 次，然后向每个孔中加入 1 mL 的细菌。
   10. 保留一些感染混合物（至少 100 μL）用于测定 MOI（参见步骤 3.3）。
   11. 用盖子盖住板，并用聚乙烯食品保鲜膜包裹板，以避免泄漏。将板放入离心机中，以 200 x g 的速度旋转样品 10 分钟以同步侵袭。将板移至组织培养箱中，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   12. 用 MCDB-131 全培养基洗涤样品 4 次，然后将它们移入组织培养箱中。再过 30 分钟后，用补充有 20 μg/mL 庆大霉素的培养基替换培养基。
3. 确定感染复数 （MOI）
   1. 在宿主细胞与细菌的初始 30 分钟孵育期间，准备 10 倍连续稀释的感染混合物以确定 MOI。通过将 100 μL 感染混合物与 900 μL 的 1x PBS（^10-1 稀释）混合，进行 10 倍稀释。然后，将 100 μL 的 ^10-1 稀释液与 900 μL 的 PBS（^10-2 稀释液）混合。
   2. 继续作，直到获得 ^10-5 的稀释度。
      注意:所有溶液在稀释前都需要充分混合，并且每个步骤都应使用新鲜干净的移液器吸头。
   3. 稀释后，将 100 μL 的 ^10-2 - ^10-5 稀释液放在 BHI/琼脂/氯霉素/链霉素板的中心（如果合适）。
   4. 用火弯曲移液管以形成一个钩子，用玻璃移液器制作一个撒布器。将移液器浸入 100% 乙醇中进行消毒，然后用火焰烧掉乙醇。
   5. 撒布器冷却后，从 ^10-5 稀释开始，将细菌稀释液均匀地撒在板上，然后移动到更浓缩的混合物。将板在 37 °C 下倒置孵育 2 天。
   6. 根据菌落密度，确定 ^10-3 和 ^10-4 或 ^10-4 和 ^10-5 稀释板的菌落数。按如下方式计算 MOI:
      ×稀释因子的菌落数 ÷初始添加的体积 = 每 μL 的菌落形成单位 （CFU） 数
      每 μL 的 CFU 数量 ×每孔的细菌混合物体积 = 每孔的 CFU 数量
      每孔的 CFU 数量 × 每孔的细胞体积 = 每个细胞的细菌数量
      注:CFU 代表菌落形成单位。
   7. 对两个板的 MOI 求平均值，以获得最终的 MOI。

4. 定量延时显微镜评估细胞外基质刚度

在 24 孔板上制备 PA 水凝胶（参见步骤 1），接种 HMEC-1 细胞（参见步骤 2），并如上所述培养过夜的 JAT983 培养物（参见步骤 3）。

1. 感染当天，通过每 mL MCDB-131 全培养基混合 10 μL 细菌沉淀来制备感染混合物。小心地从 24 孔板的孔中取出培养基，并向每个孔中加入 1.9 mL 的 MCDB-131 完全培养基和 0.1 mL 的细菌混合物。
   注:该测定中使用的较低 MOI 对于分析从侵入宿主细胞的单个细菌开始的传播事件是必要的。
2. 用盖子盖住板，并用保鲜膜密封以避免泄漏。将板放入离心机中，以 200 x g 的速度旋转样品 10 分钟以同步侵袭。
3. 将板移入组织培养箱中并孵育 5 分钟。
4. 用培养基洗涤样品 4 次，然后将它们移至组织培养箱中。再放置 5 - 7 分钟后，用添加 20 μg/mL 庆大霉素的培养基更换培养基。
5. 将板在培养箱中额外孵育 5 小时，以使 actA 启动子打开并驱动 mTagRFP 开放阅读框的表达。
6. 通过在 Leibovitz 的 L-15 中补充 10% 胎牛血清、10 ng/mL 表皮生长因子和 1 μ g/mL 氢化可的松来制备活体显微镜培养基><。 注:L-15 已经含有 2 mM L-谷氨酰胺，因此无需像 MCDB-131 培养基那样添加额外的。
7. 将 1 μL 1 mg/mL Hoechst 染料与 1 mL L-15 全培养基混合，并将其添加到每个孔中以对细胞核进行染色。将细胞置于组织培养箱中 10 分钟，然后在每个孔中用 1 mL 补充有 20 μg/mL 庆大霉素的 L-15 完全培养基替换 L-15 全培养基。用盖子盖住板，并将其置于平衡至 37 °C 的显微镜环境室（参见材料表）中。
   注:对于成像，使用倒置落射荧光显微镜与 CCD 相机（参见材料表）和 0.75 NA 的 20 倍平局萤石空气物镜。功率设置为 50%，曝光时间为 50 毫秒。用于 mCherry 的显微镜滤光片的激发和发射分别为 470/525 nm。
8. 使用自动对焦功能每 5 分钟对多个位置进行成像，以监测 Lm 如何通过接种在不同刚度水凝胶上的 HMEC-1 单层传播><。 注意:L-15 用 HEPES 缓冲，因此在成像过程中不需要使用 CO₂。

表 1.不同刚度的聚丙烯酰胺 （PA） 水凝胶的组成。在此表中，达到给定刚度（杨氏模量，E）的 40% 丙烯酰胺原液百分比和 2% 双丙烯酰胺原液的百分比表示在不同的列中。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 杨氏模量 （E， kPa） 丙烯酰胺 % （来自 40% 库存） 双丙烯酰胺 % （来自 2% 库存） 0,6 3 0,045 3 5 0,075 10 10 0,075 20 8 0,195 70 10 0,45

结果

图 1:驻留在不同刚度的薄双层荧光珠包埋聚丙烯酰胺 （PA） 水凝胶上的宿主细胞的细菌感染测定。答。玻璃盖玻片经过化学改性，可实现水凝胶附着。湾。将 3.6 μL 的 PA 混合物沉积在玻璃底部。混合物用 12 毫米圆形玻璃盖玻片覆盖，以便进行聚合。D.用针头注射器取出盖玻片。E.在底层顶部加入 2.4 μL 含微珠的 PA 溶液，并用圆形玻璃盖玻片盖上。在孔中加入缓冲液并去除盖玻片。 G.紫外线照射 1 小时确保灭菌。H.在凝胶上加入含 Sulfo-SANPAH 的溶液，然后将其置于紫外线下 10 分钟。用水缓冲液洗涤水凝胶，然后与胶原...

材料