通过噬斑实验测定实验性药物的抗病毒功效

摘要

来源：Yadavalli, T.，等。利用猪角膜组织外植体研究单纯疱疹病毒-1抗病毒药物的疗效。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了使用感染性猪角膜中获得的病毒进行蚀斑试验的方法。猪角膜用于测试实验性药物的抗病毒效果。

方案

1. 病毒感染定量

注意：应每天评估猪角膜中的病毒滴度，以分析药物治疗的效果。

1. 为定量病毒，若使用本实验中的6孔板，则以每孔5 × 10⁵个细胞的密度接种Vero细胞。感染前一天进行接种。将接种后的细胞培养过夜，以确保在病毒定量时细胞达到汇合状态。
2. 将500 µL无血清培养基分装至多个微量离心管中。将无菌棉签浸入装有无血清培养基的离心管中，棉签头部需浸润至少5分钟，方可使用。
3. 在不扰动底层培养基的情况下，将感染的猪角膜培养板转移至生物安全柜中。用湿润的棉签在感染猪角膜中心直径5 mm范围内，顺时针旋转涂擦3圈，再逆时针旋转涂擦3圈，避免施加过大压力。
4. 将棉签重新插入含无血清培养基的微量离心管中，顺时针和逆时针各旋转5次。棉签的金属杆应剪短，使其能完全放入微量离心管中，并可盖紧管盖。
5. 将含有棉签头的微量离心管置于涡旋振荡器上，高速涡旋1分钟。
6. 对这些样本进行噬斑实验以定量病毒。
   注意：该定量步骤需在感染后第2天、第4天进行，可选择性在第6天进行。

2. 通过噬斑实验进行病毒定量

注意：进行噬斑试验时，将Vero细胞培养并接种于6孔板中，并在试验开始前确保细胞融合度达到90%。使用一个细胞完全融合的75 cm²培养瓶。以下所有步骤均需在生物安全柜内进行。

1. 吸除培养基后，用 10 mL 新鲜的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤锥形瓶中汇合的 Vero 细胞单层。吸除第一遍洗涤液后，再次用 PBS 重复洗涤一次。
2. 向细胞单层中加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶。将锥形瓶置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。肉眼观察，确保细胞已从瓶内表面脱落。若未完全脱落，再等待 5 分钟后重新检查。当细胞明显脱落时，向单层中加入 9 mL 完全培养基，以确保细胞完全从瓶壁脱离。
3. 将锥形瓶中的所有细胞连同完全培养基一起收集，转移至 15 mL 离心管中。
4. 对于用于蚀斑试验的每孔 6 孔板，取离心管中的 300 µL 细胞悬液接种至每孔，再向每孔补充 2 mL 完全培养基。将 6 孔板放入培养箱过夜，使细胞生长并形成汇合单层。
5. 为进行蚀斑试验，在对病毒进行定量前，需先对样品进行系列稀释。
6. 使用无血清培养基在微量离心管中对病毒进行 10 倍系列稀释，直至达到 10^-8 稀释度。当稀释至 10^-3 时，吸除 6 孔板中细胞的生长培养基，将 1 mL 该稀释液加入细胞单层中，此为感染步骤。将感染后的 6 孔板置于 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。
7. 吸除现有感染培养基，用 PBS 轻柔洗涤两次以润湿细胞，然后向所有 6 个孔中每孔加入 2 mL 含甲基纤维素的培养基。孵育 72 小时，或直至可见蚀斑形成。蚀斑表现为细胞单层中出现的小片空隙。
8. 沿每孔边缘缓慢加入 1 mL 甲醇，以孔壁作为导流。将 6 孔板在室温下孵育 15 分钟。缓慢吸除每孔内容物，避免扰动或震荡细胞单层。
9. 向 6 孔板的每孔加入 1 mL 结晶紫工作液，确保覆盖所有细胞。将 6 孔板置于避光条件下孵育 30 分钟。通过吸除方式弃去结晶紫溶液，并将各孔在吸水纸上干燥。
10. 计数最高稀释度孔中的蚀斑数量，以定量起始溶液中的总病毒含量。重复该过程两次，以确认病毒滴度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30 G 一次性注射针头。	BD	305128
500 mL 玻璃瓶。	Thomas Scientific	844027
具有生物安全二级（BSL-2）认证的生物安全柜。	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" 无菌海藻酸钙标准拭子。	Puritan	22029501
细胞刮刀 - 25 cm	Biologix BE	70-1180 70-1250
离心管
结晶紫	Sigma Aldrich	C6158	将粉末储存在避光处
杜尔贝科改良伊格尔培养基 - DMEM	GIBCO	41966029	4 °C 保存至使用
乙醇	Sigma Aldrich	E7023
胎牛血清 - FBS	Sigma Aldrich	F2442	分装至 50 mL 管中，冻存备用
Vero 细胞	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1586
涡旋振荡器
甲醇
甲基纤维素
微量离心管
猪角膜	Park Packaging Co., Chicago, IL		按需特殊订购
实验台防护垫 - 按需使用。	Thermofisher Scientific	S42400
血清移液管	Thomas Scientific	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
血清移液设备。	Thomas Scientific	Ezpette Pro
体视显微镜	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
组织培养瓶，T175 cm²。	Thomas Scientific	T1275
可维持 5% CO₂ 和 37 °C 温度的组织培养孵育箱	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
组织培养处理板（6 孔）。	Thomas Scientific	T1006
胰蛋白酶