一种测定病毒感染细胞上多微生物生物膜启动的实验方法

摘要

来源：Plotkin, B. J. 等，细菌与真菌在病毒感染细胞上生物膜形成的起始测定。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了细菌和真菌在病毒感染的细胞上启动多微生物生物膜形成的过程。单纯疱疹病毒感染会阻碍细菌与细胞的黏附，从而阻止细菌与真菌的共定位。相比之下，未感染的细胞则表现出细菌与真菌的共定位，并启动生物膜的形成。

方案

1. 单纯疱疹病毒株及其处理

注意：本实验采用带有β-半乳糖苷酶报告基因活性的重组非扩散型HSV-1(KOS) gL86和HSV-2(KOS) 333gJ^-。

1. 使用同一批次的病毒，以1:1的比例与含20%胎牛血清（FBS）和脱脂奶粉的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）混合，于-80 °C保存备用。在病毒批次储存前，通过以下方法测定病毒浓度： o邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（ONPG）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-Gal）检测
2. 通过报告病毒进入实验，使用X-Gal染色法测定每次实验的病毒活力和感染复数（MOI），方法如前所述（图1).
3. 将病毒用 Opt-MEM 稀释至所需 MOI。染色前用多聚甲醛（0.5 ml/孔）固定单层细胞。将病毒活性对照与多微生物检测板平行设置于另一独立的微量滴定板中。

2. HeLa 299 细胞操作

1. 在含有4.5 g/L葡萄糖、10%灭活胎牛血清（FBS）、庆大霉素（50 µg/ml）和L-谷氨酰胺的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。当细胞融合度达到80%时，使用胰蛋白酶溶液（乙二胺四乙酸，0.53 M EDTA；0.05%胰蛋白酶；每瓶5 ml）进行传代。

3. C. albicans 操作处理

注意：从临床实验室来源获得的 C. albicans保存在-80 °C的Remmel脱脂牛奶2x培养基中。

1. 将冻存菌种接种至沙氏葡萄糖培养基（37 °C）中。培养24小时后进行传代培养 C. albicans 接种于Fungisel培养基（37 °C；48小时）后使用。
2. 生成菌丝管（GT）形态（挑取代表性菌落；3 ml FBS；37 °C孵育3小时；测定吸光度）₆₀₀ （摘要₆₀₀），0.3）。孵育后，将GT洗涤（Hanks平衡盐溶液，HBSS；2倍体积；4,000 × g）。将洗涤后的GT加入预热的HBSS（37 °C；0.32 Abs₆₀₀）。通过血细胞计数板计数确定，GT细胞应占所观察细胞的99%。
3. 通过挑取有代表性的Fungisel菌落制备酵母形态（YF）储备悬浮液（HBSS，3 ml；0.32 Abs₆₀₀）。使用血细胞计数板在显微镜下计数每毫升中YF形态的数量。通过血细胞计数板计数确定，YF形态应占观察到的细胞总数的99%。
4. 制备工作用真菌悬液（将250 µl GT或YF储备液加入25 ml HBSS中；37 °C；10⁵ 菌落形成单位，（CFU/ml）

4. 金黄色葡萄球菌（S. aureus）操作

1. 将金黄色葡萄球菌（S. aureus）美国典型培养物保藏中心（ATCC 25923）菌株保存于-80 °C（含2倍脱脂牛奶的Remmel培养基中）。在绵羊血琼脂培养基（5%；37 °C；24小时）上进行培养。挑选典型菌落，并于2天内转移至甘露醇盐培养基中制备菌种（37 °C；18小时）。
2. 制备金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌液储备液（3 ml HBSS；OD₆₀₀为1.32；浓度为10⁸ CFU/ml）
   1. 制备工作用金黄色葡萄球菌（S. aureus）储备液（取100 µl上述储备液加入25 ml HBSS中；终浓度为10⁵ CFU/ml）。

5. Candida 和 S. aureus 悬液

1. 制备混合的 C. albicans 和 S. aureus 悬液（将250 µl YF或GT储备液与100 µl S. aureus 储备液加入25 ml HBSS中）。

6. 多微生物生物膜检测

1. 在96孔板中接种200 µl浓度为2 × 10⁵ 个HeLa细胞/ml的细胞悬液（汇合度85%）。轻轻摇动培养板（30–45分钟；37 °C），然后置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育18小时。用Opt-MEM洗涤单层细胞一次，随后在每孔中加入100 µl Opt-MEM稀释的HSV病毒（HSV-1 (KOS) gL86 或 HSV-2 (KOS) 33 gJ^-），感染复数（MOI）分别为50和10。将培养板于37 °C、5% CO₂条件下孵育3小时。每天仅使用一种病毒株。
2. 用含Mg⁺²和Ca⁺²的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤感染后的单层细胞一次（100 µl），弃去PBS后每孔保留25 µl，再加入预温的HBSS。
   1. 根据表1所示，加入YF、GT和/或S. aureus的工作悬液（100 µl；效应细胞与靶细胞比例为5:1；n=16）。将培养板静置孵育30分钟（37 °C，5% CO₂）。
3. 孵育结束后，逐列吸除液体，并立即用300 µl含Mg⁺²和Ca⁺²的PBS重新填充。重复该洗涤步骤两次，然后每孔加入200 µl经滤膜除菌的放射性免疫沉淀分析裂解缓冲液（RIPA；1:50稀释）。
4. 迅速吹打HeLa细胞裂解物，取50 µl接种于甘露醇盐琼脂（MS）和/或Fungisel（F）培养基上（参见图2）。使用90°弯角的玻璃涂布棒将裂解物均匀涂布。将平板于37 °C孵育18小时后，人工计数每块平板上的菌落数。对照组包括S. aureus和/或C. albicans在未感染HSV的HeLa细胞上的黏附实验。

表1. 多微生物相互作用中微生物黏附的通用模板测定。 GT= Candida albicans 菌丝管表型；YF= C. albicans 酵母形态表型；MSSA= 甲氧西林敏感型Staphylococcus aureus；MS= 甘露醇盐培养基；F= Fungisel培养基。

结果

图1. HeLa细胞中HSV-1感染剂量依赖性的X-gal染色结果。 HeLa细胞以不同感染复数（MOI）感染HSV-1后进行X-gal染色。（A）96孔板中未感染的对照HeLa细胞，经X-gal染色；初始放大倍数为20倍；（B）96孔板中以感染复数（MOI）为10的HSV-1感染的HeLa细胞，经X-gal染色；初始放大倍数为20倍；（C）96孔板中以感染复数（MOI）为50的HSV-1感染的HeLa细胞，经X-gal染色；初始放大倍数为20倍；比例尺适用于所有图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C.albicans
BBL 沙氏葡萄糖琼脂	BD	211584
真菌选择性琼脂（Fungisel Agar）	Dot Scientific	7205A
S.aureus
甘露醇盐琼脂	Troy Biologicals	7143B
羊血琼脂	Troy Biologicals	221239
Hela 细胞
1x DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基，含 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠）	Corning	10-017-CM
庆大霉素 50 mg/ml	Sigma	1397	在完全 DMEM 中终浓度为 50 µg/ml
胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.05% 胰蛋白酶，0.53 M EDTA），1X	Corning	25-052-CI
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150	在完全 DMEM 中终浓度为 10%
其他培养基与试剂
ONPG	Thermo Scientific	34055
超纯 X-gal	Invitrogen	15520-018
1x HBSS（汉克斯平衡盐溶液）	Corning	20-021-CV
1x PBS	Dot Scientific	30042-500
RIPA 裂解液	Life Technologies	89901
耗材
96 孔板	Evergreen Scientific	222-8030-01F
培养管（100×13）	Thomas Scientific	9187L61