一种测定病毒感染细胞上多微生物生物膜启动的实验方法

摘要

来源：Plotkin, B. J. 等，细菌与真菌在病毒感染细胞上生物膜形成的起始测定。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了细菌和真菌在病毒感染的细胞上启动多微生物生物膜形成的过程。单纯疱疹病毒感染会阻碍细菌与细胞的黏附，从而阻止细菌与真菌的共定位。相比之下，未感染的细胞则表现出细菌与真菌的共定位，并启动生物膜的形成。

方案

1. 单纯疱疹病毒株及其处理

注意：本实验采用带有β-半乳糖苷酶报告基因活性的重组非扩散型HSV-1(KOS) gL86和HSV-2(KOS) 333gJ^-。

1. 使用同一批次的病毒，以1:1的比例与含20%胎牛血清（FBS）和脱脂奶粉的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）混合，于-80 °C保存备用。在病毒批次储存前，通过以下方法测定病毒浓度： o邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（ONPG）和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-Gal）检测
2. 通过报告病毒进入实验，使用X-Gal染色法测定每次实验的病毒活力和感染复数（MOI），方法如前所述（图1).
3. 将病毒用 Opt-MEM 稀释至所需 MOI。染色前用多聚甲醛（0.5 ml/孔）固定单层细胞。将病毒活性对照与多微生物检测板平行设置于另一独立的微量滴定板中。

2. HeLa 299 细胞操作

1. 在含有4.5 g/L葡萄糖、10%灭活胎牛血清（FBS）、庆大霉素（50 µg/ml）和L-谷氨酰胺的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。当细胞融合度达到80%....

结果

图1. HeLa细胞中HSV-1感染剂量依赖性的X-gal染色结果。 HeLa细胞以不同感染复数（MOI）感染HSV-1后进行X-gal染色。（A）96孔板中未感染的对照HeLa细胞，经X-gal染色；初始放大倍数为20倍；（B）96孔板中以感染复数（MOI）为10的HSV-1感染的HeLa细胞，经X-gal染色；初始放大倍数为20倍；（C）96孔板中以感染复数（MOI）为50的HSV-1感染的HeLa细胞，经X-gal染色；初始放大倍数为20倍；比例尺适用于所有图像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C.albicans
BBL 沙氏葡萄糖琼脂	BD	211584
真菌选择性琼脂（Fungisel Agar）	Dot Scientific	7205A
S.aureus
甘露醇盐琼脂	Troy Biologicals	7143B
羊血琼脂	Troy Biologicals	221239
Hela 细胞
1x DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基，含 4.5 g/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠）	Corning	10-017-CM
庆大霉素 50 mg/ml	Sigma	1397	在完全 DMEM 中终浓度为 50 µg/ml
胰蛋白酶-EDTA 溶液（0.05% 胰蛋白酶，0.53 M EDTA），1X	Corning	25-052-CI
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11150	在完全 DMEM 中终浓度为 10%
其他培养基与试剂
ONPG	Thermo Scientific	34055
超纯 X-gal	Invitrogen	15520-018
1x HBSS（汉克斯平衡盐溶液）	Corning	20-021-CV
1x PBS	Dot Scientific	30042-500
RIPA 裂解液	Life Technologies	89901
耗材
96 孔板	Evergreen Scientific	222-8030-01F
培养管（100×13）	Thomas Scientific	9187L61