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1. 溶液与培养基
- 根据表1制备2倍浓度的罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、沙氏葡萄糖肉汤和沙氏葡萄糖琼脂。
2. 真菌接种物培养条件
- 将所有真菌菌株以含35%甘油的冻存液在-80 °C条件下保存，直至使用。
- 每次实验前执行以下步骤。
- 对于Candida albicans菌株：
- 解冻一支冻存管，取200 µL转移至含有10 mL沙氏葡萄糖肉汤的无菌50 mL聚丙烯管中，于30 °C、振荡（200 rpm）条件下培养过夜。注意将试管倾斜并略微打开管盖，以利于培养物更好地通气。
- 对于Cryptococcus neoformans菌株：
- 刮取冻存管表面的冷冻菌体，将细胞接种至沙氏葡萄糖琼脂平板上，于30 °C培养48小时。待出现单菌落可见生长后，用封口膜密封平板并置于冰箱（4 °C）中保存，最多可保存15天。
- 使用无菌牙签或无菌接种环从平板上挑取一个中等大小的单菌落，接种至装有10 mL沙氏葡萄糖肉汤的无菌50 mL锥形管中，于30 °C、振荡（200 rpm）条件下培养约24小时。
- 培养时间不得超过24小时。注意将试管倾斜并略微打开管盖，以保证良好通气。每次测试前对细胞生长阶段进行标准化非常重要，因为这是影响抗微生物耐药性的关键因素。
注意：本实验中两种真菌均在30 °C下培养以实现快速增殖，但可根据研究目的调整温度，例如模拟临床治疗条件（37 °C）。最重要的是，应预先确定每种真菌分离株的初始培养时间，并在所有测试中保持一致，以确保实验的可重复性。
- 真菌培养完成后，将锥形管在室温下以1,200 × g离心5分钟收集菌体，弃去上清液，加入10 mL PBS。
- 重悬菌体后，再次在室温下以1,200 × g离心5分钟。
- 重复PBS洗涤和离心操作两次。第三次洗涤后，根据菌体沉淀量，将菌体重悬于5 mL的2倍浓度RPMI-1640培养基中。
- 根据细胞悬液的浊度，在微量离心管中用培养基制备1 mL的1:100或1:1,000稀释液。
- 取10 µL上述稀释液，加入血细胞计数板腔室中，在显微镜下计数四个角区的总细胞数。按以下公式计算细胞浓度：(四个角区总细胞数/4) × 稀释倍数 × 104（计数板稀释常数）。
- 若所研究菌株的活力计数与生长条件已建立系统性关联，则可认为其活力为100%。
注意：可通过反向平板法对活力计数进行标准化和质量控制，具体方法参照欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）针对酵母菌的抗真菌最小抑菌浓度（MIC）测定法。
- 若尚未建立所研究菌株的生长与活力相关性，则需借助可选择性染色死细胞的染料（如曙红B11、台盼蓝或詹纳斯绿）在血细胞计数板中计数活细胞，以测定真菌活力。仅当此时菌群活力达到90%或以上时，方可用于本实验方案。
注意：死/活染色法可能不适用于某些特定真菌，请在使用前先行测试。例如，台盼蓝染色法对C. neoformans效果不佳。
- 随后，在2倍浓度RPMI-1640培养基中制备细胞悬液（即RPMI-1640培养基中的2倍调整接种量）。对于96孔板，每块板建议准备5 mL细胞悬液。
- 对于所有C. albicans菌株，制备浓度为4 × 103 个细胞/mL的储备细胞悬液。该浓度为每孔最终细胞浓度（2 × 103 个细胞/mL）的2倍。
- 对于C. neoformans菌株，制备浓度为2 × 104 个细胞/mL的储备菌液。该浓度为每孔最终细胞浓度（1 × 104 个细胞/mL）的2倍。
- 对于其他真菌，应结合已知抗真菌药物，测试何种浓度在特定研究中与培养时间最为匹配，并考虑真菌的代谢速率和倍增时间。
3. 肽类（未知试剂）
- 将冻干的多肽在 -20 °C 下储存，并在每次实验前用去离子水溶解。溶解于水后的最长储存时间取决于每种多肽的性质。
- 准备用于检测的最高终浓度两倍的多肽分装液（2X）。理想情况下，应分装少量多肽，每份足以一次性使用，以避免反复冻融。
注意： 浓度的选择应基于文献报道及多肽的特性。建议起始时对多肽进行约 100 µM 的系列稀释，然后根据实验结果调整该浓度范围。
4. 参照抗真菌药物（阳性对照）
- 对于用水稀释的药物：配制分析所需最高浓度的2倍浓度溶液（稀释步骤参见第5节：抗真菌实验）。
- 对于 C. albicans 菌株，配制128 µg/mL的氟康唑溶液或128 µg/mL的卡泊芬净溶液。平板中的终浓度均为64 µg/mL。
- 对于 C. neoformans 菌株，配制32 µg/mL的两性霉素B（水溶性溶液）。平板中的终浓度为16 µg/mL。
注意：通常两性霉素B使用二甲基亚砜（DMSO）进行稀释，因为该抗真菌药物在水中溶解度较低。然而，目前已有 commercially available 的水溶性两性霉素B制剂。
- 对于使用有机溶剂稀释的抗真菌药物：先用DMSO配制100倍浓度的储备液，然后用水稀释至10倍浓度后使用。
注意：因此，孔板中DMSO的最终浓度不应超过1%。需设置一孔真菌在含1% DMSO的培养基中生长作为对照，因为某些真菌对该浓度的溶剂耐受性较差。请注意DMSO具有光敏性，因此在培养期间应使用铝箔包裹培养板或将培养板置于避光环境中。
5. 抗真菌活性检测
注意：体外抗真菌实验根据美国临床与实验室标准协会（CLSI）M27-A3指南中的肉汤微量稀释法敏感性试验进行，部分步骤有所修改。
- 在96孔聚苯乙烯微量培养板中，将每种肽和对照抗真菌药物进行两倍系列稀释，最终体积为50 µL。
- 使用移液器，在A行1-3列中加入100 µL浓度为所需最高终浓度2倍的抗真菌药物/肽溶液。
- 使用多通道移液器，在B至H行的其他孔中各加入50 µL无菌水。
- 从最高浓度孔（A行）中吸取50 µL，转移至下一浓度孔（B行），并充分混匀。
- 重复上述步骤，直至最低浓度孔（H行），并将该孔中的50 µL弃去。第11和12列（A、B、C行）仅保留水，作为空白对照或阴性/生长对照。
- 向每个孔（1-3列及第11列（阴性/生长对照））加入50 µL用RPMI-1640培养基配制的2倍调整接种液；C. albicans的终浓度为2 × 103 cells/mL，C. neoformans菌株的终浓度为104 cells/mL。
- 制备空白对照（50 µL水 + 50 µL不含细胞的2倍RPMI-1640培养基）和阴性/生长对照（50 µL水 + 50 µL不含抗真菌药物的2倍调整接种液RPMI-1640培养基），并按上述方法加入微孔板中。
- 对每种待测化合物及选定的抗真菌对照药物重复上述操作（4-10列）。
注意：系列稀释可在板上垂直进行（如本实验所示），也可水平进行（即，当需要测试的化合物/提取物的稀释梯度为八个或更多时）。
- 若化合物、参比药物或其任何组分对光敏感，则应在避光条件下操作，用铝箔包裹培养板或在暗室中孵育。
- 考虑以下可选建议。
- 使用允许气体交换的透明封板膜密封培养板，有助于减少蒸发。
- 将培养板置于湿盒中，也有助于减少蒸发。
- 将培养板在37 °C下孵育24 h或48 h（所有C. albicans菌株），C. neoformans则在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育48 h。较低的终体积（100 µL）可确保无液体溢出。
注意：对于C. albicans菌株，24 h与48 h的MIC读数之间无显著差异。然而，48 h的读数更易于观察。
- 在孵育前后，借助倒置光学显微镜观察所有孔，以验证形态变化并检查是否存在污染迹象。
注意：可在实验结束时进行肉眼观察并拍照记录。每次读数前需轻微混匀培养板。若未观察到细胞聚团或菌丝形成，也可通过测定600 nm处的光密度（OD）进行定量读数。
- 实验应在不同日期至少重复三次。
表1. 培养基与试剂的配制。
| 培养基 | 准备 |
| 2X 罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）1640 培养基 – 500 mL | 10.4 g RPMI-1640（含L-谷氨酰胺和酚红；不含碳酸氢盐） |
| 330 mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS) |
| 用……调节至 pH 7.0 NaOH |
| 通过过滤（0.22 µm 滤膜）灭菌 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 137 mM NaCl |
| 2.7 mM KCl |
| 10 mM Na2HPO4 |
| 2 mM KH2PO4 |
| 121°C 下高压灭菌 15 分钟。 |
| 沙氏葡萄糖肉汤 | 15 g 粉末溶于 500 mL 蒸馏水中。 |
| 用 NaOH 调节 pH 至 7.0 |
| 121°C 高压灭菌 15 分钟。 |
| 沙保弱葡萄糖琼脂 | 32.5 g 粉末溶于 500 mL 蒸馏水中。 |
| 用 NaOH 调节至 pH 7.0 |
| 121°C 下高压灭菌 15 分钟。 |