一种用于抗真菌化合物筛选的体外液体微量稀释法检测

摘要

来源：de-Souza-Silva, C. M., 等 肉汤微量稀释法 体外 筛选：一种检测新型抗真菌化合物的简便快速方法 视频实验杂志 (2018).

本视频演示了一种 体外 使用肉汤微量稀释法筛选抗真菌化合物的检测方法。将待测化合物在微孔板中进行系列稀释，并加入真菌接种物后孵育。孵育结束后，观察各孔中是否出现可见的真菌生长，以评估待测化合物的抗真菌活性及其最小抑菌浓度（MIC）。

方案

1. 溶液与培养基

1. 根据表1制备2倍浓度的罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、沙氏葡萄糖肉汤和沙氏葡萄糖琼脂。

2. 真菌接种物培养条件

1. 将所有真菌菌株以含35%甘油的冻存液在-80 °C条件下保存，直至使用。
2. 每次实验前执行以下步骤。
   1. 对于Candida albicans菌株：
      1. 解冻一支冻存管，取200 µL转移至含有10 mL沙氏葡萄糖肉汤的无菌50 mL聚丙烯管中，于30 °C、振荡（200 rpm）条件下培养过夜。注意将试管倾斜并略微打开管盖，以利于培养物更好地通气。
   2. 对于Cryptococcus neoformans菌株：
      1. 刮取冻存管表面的冷冻菌体，将细胞接种至沙氏葡萄糖琼脂平板上，于30 °C培养48小时。待出现单菌落可见生长后，用封口膜密封平板并置于冰箱（4 °C）中保存，最多可保存15天。
      2. 使用无菌牙签或无菌接种环从平板上挑取一个中等大小的单菌落，接种至装有10 mL沙氏葡萄糖肉汤的无菌50 mL锥形管中，于30 °C、振荡（200 rpm）条件下培养....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
培养基与试剂
含L-谷氨酰胺、不含碳酸氢钠的RPMI 1640培养基	赛默飞世尔科技	31800-022
3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS)	Sigma-Aldrich		用于配制2倍浓度RPMI培养基的缓冲液
氯化钠（NaCl）	动力学	1528-1	磷酸盐缓冲液（PBS）中的 137 mM
氯化钾（KCl）	J.T.Baker	3040-01	2.7 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）
磷酸氢二钠（Na2HPO4）	Sigma-Aldrich	V000129	10 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）
磷酸二氢钾（KH2PO4）	Sigma-Aldrich	60230	2 mM 磷酸盐缓冲液（PBS）
BD Difco 沙氏葡萄糖肉汤	BD	238230
BD Difco 沙氏葡萄糖琼脂	BD	210950
甘油	Sigma-Aldrich	V000123	35%
无菌水
抗真菌药物
两性霉素B	Sigma-Aldrich	A2942
氟康唑	Sigma-Aldrich	F8929
卡泊芬净	Sigma-Aldrich	PHR1160
塑料
50 mL 离心管	Sarstedt	62.547.254
培养皿	J.Prolab	0304-5
96孔板	康宁	3595
无菌溶液储液器	KASVI	K30-208	使用多通道移液器吸取溶液
仪器与其他材料
光学显微镜	尼康	E200MV
离心	赛默飞世尔科技	MegaFuge 16R
培养箱	Ethik 技术	403-3D	设定为 37° C
摇床	新不伦瑞克科学公司	Excella E25	设定为 37°C，200 RPM
细胞计数板，Neubauer	BOECO 德国	BOE 13
多通道移液器	HTL	5123