一种用于测定抗生素处理下细菌存活率的ATP利用检测法

摘要

来源：Wang, Liang-Chun 等. 抗生素敏感性的定量检测 Neisseria gonorrhoeae 使用ATP利用型商用检测试剂盒和活/死细胞染色法检测聚集体。 视频实验杂志 (2019).

本视频介绍了一种使用荧光素酶发光试剂的简单ATP检测方法。该检测方法用于定量测定经头孢曲松处理后Neisseria gonorrhoeae的存活情况。

方案

1. GC 聚集体的活力定量分析

1. 使用无菌拭子收集淋球菌（GC）。从平板上刮取GC，并将其重悬于预热的含4.2% NaHCO₃和1% Kellogg溶液的培养基（GCP，表1）中。采用650 nm波长的分光光度法（OD 650为1时约等于~1 × 10⁹ CFU/mL）测定细菌悬液的浓度。
2. 将GC浓度调整至约1 × 10⁸ CFU/mL。
3. 取99 µL调整后的GC悬液加入96孔板的各孔中。
4. 将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育6小时，使细菌聚集。
5. 向每孔中加入1 µL系列稀释的头孢曲松（1000、100、50、25、12.5、6.2、3.1、1.5、0.8、0.4、0.2 µg/mL），部分孔不加药物作为对照。
6. 将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育24小时。
7. 对每孔悬液在144 W、20 kHz条件下进行超声处理，每次5秒，重复3次。
8. 向每孔中加入100 µL市售ATP利用发光试剂，用移液器吹打混匀3次，然后在37 °C、5% CO₂条件下孵育15分钟。
9. 小心地将每孔中的150 µL混合液转移至新的96孔黑色微孔板的对应孔中，避免产生气泡。
10. 使用酶标仪在560 nm波长下测定各孔的发光值。
11. 通过经系列浓度头孢曲松处理后的读数与未处理孔读数的比值，计算细菌存活率。

2. GC 聚集体活/死荧光显微分析

1. 使用无菌棉签收集淋球菌（GC）。从平板上刮取淋球菌，并将其重悬于预热的含1% Kellogg补充剂的GCP培养基中。
2. 在650 nm波长下通过分光光度法测定细菌数量，并将淋球菌浓度调整至约1 × 10⁷ CFU/mL。
3. 将198 µL淋球菌悬液加入8孔盖玻片底共聚焦培养皿中。
4. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂条件下孵育6小时，以促进菌落聚集形成。
5. 在每种聚集条件下，向每个孔中加入2 µL头孢曲松（100 µg/mL或不同稀释度），并在37 °C、5% CO₂条件下孵育所需时间。
6. 向每个孔中加入0.6 µL活/死染色溶液混合物，在37 °C、5% CO₂条件下孵育20分钟。
7. 使用共聚焦显微镜获取Z轴序列图像（也可使用性能相当的显微镜）。
8. 使用ImageJ软件分析图像，测量淋球菌聚集物的大小以及每个聚集物中活/死染色的荧光强度比（FIR）。

表1：1 L GCP 细菌培养基的配制配方。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100x Kellogg's 补充剂
琼脂	United States Biological	A0930
BacTiter 检测试剂盒	Promega	G8232
头孢曲松	TCI	C2226
Difco GC 培养基基础	BD	228950
硝酸铁，九水合物	Sigma-Aldrich	254223-10G
葡萄糖	Thermo Fisher Scientific	BP350-1
BacLight 活/死染色试剂	Invitrogen	L7012
MS11 淋病奈瑟菌菌株			由 Walter Reed 研究所 Herman Schneider 博士惠赠
超声破碎仪	Kontes		等同于 9110001