确定类中性粒细胞在淋巴瘤细胞对试验药物敏感性中的作用

摘要

来源：Hirz, T., 等 中性粒细胞的分离与分析以确定其在淋巴瘤细胞对治疗药物敏感性中的作用。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了一种用于研究类中性粒细胞在保护淋巴瘤细胞免受化疗药物细胞毒性作用中的功能的实验方法。通过建立由淋巴瘤细胞和类中性粒细胞组成的三维共培养体系，并将其暴露于化疗药物长春新碱（vincristine）中。类中性粒细胞与淋巴瘤细胞的直接接触可诱导后者抗凋亡蛋白的上调，从而促进淋巴瘤细胞在长春新碱存在条件下的存活。

方案

1. HL60细胞向粒细胞途径的分化及其在三维模型中与RL淋巴瘤B细胞的共培养

1. 人早幼粒细胞（HL60）向类中性粒细胞的分化
   1. 将 HL60 细胞数量调整至 3 × 10⁵ 个细胞/mL，加入 1 µM 全反式维甲酸（RA）和 1.25% 二甲基亚砜（DMSO）以诱导其分化。每孔接种 3 × 10⁵ 个 HL60 细胞至 48 孔板中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 48 小时。
   2. 随后收集细胞，在室温下以 300 g 离心 5 分钟。用完全 RPMI 培养基重悬细胞沉淀，使用细胞活力计数仪进行计数。
   3. 再用完全 RPMI 培养基稀释细胞悬液，将 HL60 细胞数量调整至 3 × 10⁵ 个细胞/mL，并再次加入 1 µM 全反式维甲酸（RA）和 1.25% 二甲基亚砜（DMSO）诱导分化。每孔接种 3 × 10⁵ 个 HL60 细胞至 48 孔板中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续培养 48 小时。
2. HL60 细胞分化（HL60diff）分析
   1. 收集细胞，在室温下以 300 g 离心 5 分钟。用完全 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基重悬细胞沉淀，使用细胞活力计数仪进行计数。
   2. 通过流式细胞术分析细胞表面标志物表达的变化。将 3 × 10⁵ 个未分化的 HL60 细胞（来自细胞培养）和 3 × 10⁵ 个 HL60diff 细胞分别加入 5 mL 塑料管中用于荧光激活细胞分选（FACS）分析，并在室温下以 300 g 离心 5 分钟。
   3. 用 50 µL 磷酸盐缓冲液-胎牛血清（PBS-FBS）（4%）重悬细胞沉淀。加入与 AF700 偶联的抗人 CD11b 抗体或与 APC 偶联的抗人 CD38 抗体（5 µL/10⁶ 个细胞）对细胞进行标记。在 4 ^oC 避光孵育 30 分钟。
   4. 用 500 µL PBS-FBS（4%）洗涤一次，在室温下以 300 g 离心 5 分钟。再用 200 µL PBS-FBS（4%）重悬细胞沉淀。
   5. 使用 图 1A 所示的设门策略及以下光学配置在流式细胞仪上进行分析：488 nm 激光：FSC-A（488 nM）、SSC-A（488/10BP）；633 nm 激光：APC（660/20 BP）、Alexa Fluor 700（730/45 BP）。
   6. 为检测 HL60diff 的形态学变化，将细胞固定于玻片上进行显微镜观察。
      1. 将 3 × 10⁴ 个未分化的 HL60 细胞（来自细胞培养）和 3 × 10⁴ 个 HL60diff 细胞分别用 150 µL 完全 RPMI 培养基重悬。将玻片、滤纸卡和样品室组装到细胞离心涂片机中，确保离心机平衡。
      2. 将每种细胞类型加入样品室中，在室温下以 1,500 rpm 离心 10 分钟。从离心机中取出玻片、滤纸卡和样品室，小心拆卸，避免损伤玻片上的细胞。弃去滤纸卡和样品室。
      3. 使用吉姆萨染色试剂盒对细胞进行染色，将玻片室温干燥 1 小时。使用 100 倍物镜在显微镜下观察细胞形态。
3. 三维（3D）培养
   注意：确保本实验所用材料保持低温，并在冰上操作。
   1. 使用无菌剪刀将 1 mL 移液枪头末端剪开，扩大开口至约 2–3 mm，用此枪头将 5 × 10⁴ 个 RL 细胞（单独或与 HL60diff 按 RL:HL60diff 1:10 的比例混合）用 300 µL 基底膜基质重悬。此步骤应避免产生气泡。
   2. 每孔接种 300 µL 细胞悬液至 24 孔板中。此步骤应避免产生气泡。将培养板在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟，然后每孔加入 1 mL 完全 RPMI 培养基，在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续培养 7 天。每两天更换一次培养基。在第 5 天加入 10 nM 长春新碱。
4. FACS 分析
   1. 培养 7 天后，吸弃培养基，每孔用 1 mL 冰冷 PBS 洗涤两次。每孔加入 3 mL 冰冷 PBS-乙二胺四乙酸（EDTA）（5 mM）。用 200 µL 移液枪头底部轻轻刮擦培养孔底部，使凝胶脱离。将培养板在冰上轻柔振荡 30 分钟。
   2. 将细胞悬液转移至无菌 15 mL 离心管中，在冰上继续轻柔振荡 30 分钟。检查是否形成均一的细胞悬液。（若未达到均一状态，可延长振荡时间或加入更多 PBS-EDTA）。
   3. 在室温下以 300 × g 离心 10 分钟。用 PBS 洗涤一次，再在室温下以 300 × g 离心 10 分钟。
   4. 用 PBS-FBS（4%）重悬细胞，加入与 PE-Cy7 偶联的抗人 CD19 抗体和与 APC 偶联的抗人 CD38 抗体（5 µL/10⁶ 个细胞）。在 4 ^oC 避光孵育 30 分钟。
   5. 用 500 µL PBS-FBS（4%）洗涤一次，在室温下以 300 g 离心 5 分钟。使用商用试剂盒用 Annexin V 和 PI 重悬细胞。
   6. 使用 图 2A 所示的设门策略及以下光学配置在流式细胞仪上进行分析：488 nm 激光：FSC-A（488 nM）、SSC-A（488/10BP）、FITC（530/30 BP）、PI（610/20 BP）、PE-Cy7（780/60 BP）；633 nm 激光：APC（660/20 BP）。确保进行荧光补偿校正。

结果

图 1. 分化后 HL60 细胞的结构参数。 (A) 前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图显示 HL60 及其分化细胞（HL60diff）。 (B) 对 HL60 和 HL60diff 细胞分别使用抗 CD11b-AF700 或抗 CD38-APC 抗体标记，随后进行流式细胞术分析。在 FSC-A 与 SSC-A 散点图中对各细胞群设门 (A) 后，检测 CD11b 或 CD38 的表达水平。 (C) HL60 细胞呈现与向粒细胞分化一致的形态学变化。显微镜下以 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	21875-034
胎牛血清 (FBS)	Gibco Invitrogen	10270-106
磷酸盐缓冲液 (PBS，含钙和镁)	Gibco Invitrogen	14040-091
长春新碱	EG labo
BD Matrigel 基底膜基质	BD Biosciences	354234	实验前一天晚上置于 4 °C 冰箱中
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
维甲酸	Sigma-Aldrich	R2625
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
乙二胺四乙酸 (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Annexin V-FLOUS 染色试剂盒	Roche	11 988 549 001
KIT RAL 555 改良吉姆萨染色试剂盒	Cosmos Biomedical	CB361550-0000
LSRII 流式细胞仪	BD Biosciences
细胞离心涂片机	Thermo Scientific
Leica DMR-XA 显微镜	Leica Microsystems
Cellometer Auto T4 细胞活力计数仪	Nexcelom Bioscience