评估细胞毒性T淋巴细胞应答中免疫优势性的实验方法

摘要

来源：Choi, J. 等，定制体内细胞毒性实验以研究肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞反应中的免疫优势性。J. Vis. Exp. (2019)

该视频展示了一种基于流式细胞术的检测方法，用于分析细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答中的免疫显性。注射的荧光标记靶细胞表现出与免疫原性表位相对应的不同荧光强度。在收集脾脏并进行分选后，高荧光强度细胞数量减少，从而证实了CTL应答中的免疫显性现象。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 使用表达 T 抗原的肿瘤细胞接种 C57BL/6 小鼠

1. 在组织培养处理过的培养瓶中，于含10%热灭活胎牛血清（FBS）、1 mM丙酮酸钠，并补充有4.5 g/L D-葡萄糖和L-谷氨酰胺（1×）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于37 °C、含10%二氧化碳（CO₂）的湿润大气环境中培养SV40转化的纤维肉瘤细胞系C57SV（或类似的T抗原⁺贴壁细胞系）。
2. 当细胞完全融合或略微过融合时，轻轻吸除并弃去培养基，用预热的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗单层细胞。
   注意：当T抗原⁺细胞达到100%融合度时，T抗原表达量最高。
3. 在生物安全柜内，加入预热的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（胰蛋白酶-EDTA），覆盖单层细胞，室温孵育直至细胞以片状脱落。多次轻敲培养瓶壁，以释放剩余贴壁细胞。
   注意：如有需要并为加快消化过程，可将培养瓶转移至37 °C培养箱中。在光学显微镜下观察，脱落的细胞会迅速呈现圆形。此步骤持续约5分钟。
4. 加入5 mL DMEM培养基，通过反复吹打每瓶中的内容物，使细胞团块解离，制备成单细胞悬液。
5. 将细胞悬液经70 µm孔径的细胞筛过滤至离心管中。
6. 在4 °C条件下，以400 × g 离心5分钟。
7. 弃去上清液，将沉淀细胞重悬于10 mL无菌、预冷的PBS中。
8. 重复步骤1.6和1.7两次。
9. 使用血细胞计数板计数细胞，制备含4 × 10⁷ 个细胞/mL的无菌PBS均匀细胞悬液。
10. 将上述悬液500 µL经腹腔注射（i.p.）注入每只成年（6–12周龄）雄性或雌性C57BL/6小鼠体内。

2. 治疗方案

1. 检测自然调节性T细胞（nTreg）对T_CD8免疫优势贡献的治疗方案
   1. 在用C57SV细胞对C57BL/6小鼠进行体内初次免疫前四天（步骤1.10），每只动物腹腔注射一次0.5 mg低内毒素、无叠氮化物的抗CD25单克隆抗体（mAb）（克隆号PC-61.5.3），以清除nTreg细胞；或注射大鼠IgG1同型对照抗体（例如克隆号KLH/G1-2-2、HRPN或TNP6A7）。
2. 检测PD-1与PD-L1(2)相互作用在塑造T_CD8免疫优势中体内作用的治疗方案
   注意：PD-L1与PD-1结合通常但并非总是介导抗原特异性T_CD8细胞的共抑制和/或耗竭。因此，可同时使用抗PD-1抗体与抗PD-L1及抗PD-L2单克隆抗体进行处理，以明确特定生物学现象中涉及的具体细胞间相互作用。

3. 靶脾细胞的制备

1. 通过颈椎脱位法处死用作脾细胞供体的性别匹配的C57BL/6小鼠（6-12周龄）。
2. 在生物安全柜内将每只小鼠仰卧放置，用70%（v/v）乙醇（EtOH）喷洒皮肤。使用无菌镊子和剪刀提起皮肤，沿腹中线做一小切口，然后以十字形剪开皮肤以暴露腹膜。
3. 用镊子将腹膜向上提起，呈帐篷状，注意不要夹取任何内脏器官。剪开腹膜以暴露腹腔，并轻柔取出脾脏。
4. 将脾脏放入含有5 mL无菌PBS的15 mL Dounce组织研磨器中。使用研磨器的玻璃杵手动施加压力，直至脾组织分散成均匀的红色单细胞悬液。
   注意：根据每实验组受体动物的数量，可能需要多只供体小鼠的脾脏用于靶细胞制备。最多可将3只脾脏一同在15 mL研磨器中匀浆。
5. 将匀浆液转移至15 mL离心管中，在4 °C下以400 × g离心5分钟。
6. 弃去上清液。将沉淀细胞重悬于4 mL氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液中，作用4分钟以去除红细胞。
   注意：此步骤对时间敏感。脾细胞在ACK裂解缓冲液中暴露过久会增加其脆性，导致非特异性细胞死亡。
7. 向每管中加入8 mL含10%热灭活FBS、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、0.1 mM最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）及1×青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基（Roswell Park Memorial Institute 1640），此后简称完全RPMI培养基（材料表）。
8. 将悬液经70 µm孔径的细胞滤器转移至新的15 mL离心管中。
9. 在4 °C下以400 × g离心5分钟。
10. 弃去上清液。将沉淀细胞重悬于12 mL完全RPMI培养基中。
11. 将脾细胞悬液均分为三份（每份4 mL），分装至三个独立的离心管中。

4. 使用无关肽和特异性肽包被靶脾细胞

1. 根据将用于刺激靶向脾细胞的肽标记试管。对照组脾细胞使用无关肽进行刺激，每组特异性靶向脾细胞则分别使用对应于T抗原来源的优势表位（位点IV）或次优势T抗原表位（位点I或位点II/III）的合成肽进行刺激（表1）。
   注意：无关肽的选择取决于实验设计及所用小鼠品系。作者通常在C57BL/6小鼠中使用gB_498-505（单纯疱疹病毒[HSV]-1的H-2K^b限制性优势肽表位）和/或GP_33-41（淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒[LCMV]的H-2D^b限制性优势肽表位）（表1）。这些肽是理想选择，原因如下：(i) 它们来源于本实验所用小鼠模型此前未接触过的病原体；(ii) 与T抗原来源的肽类似，gB_498-505和GP_33-41均受H-2^b分子限制并可与其结合。在“三峰”体内杀伤实验中，代表特异性靶细胞的两个峰可分别对应经优势肽或次优势肽刺激的脾细胞。每组肽的选择根据各实验的具体目标而定。参见图1和图2以了解此类变化的示例。在本实验方案的后续部分中，T抗原来源的位点I和位点IV将分别代表次优势肽和优势肽。
2. 向每个标记试管的内容物中加入各自对应的1 µM肽溶液，在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。
3. 如有需要，为每支试管单独使用70-μm孔径的细胞筛去除团块和碎片。
4. 在4 °C下以400 x g离心5分钟，弃去上清液。
5. 将沉淀细胞重悬于12 mL无菌冷PBS中，并重复步骤4.4一次。
   注意：尽可能彻底去除FBS非常重要，因为FBS可能在下一步中与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）结合。

5. 使用CFSE标记靶向脾细胞

1. 将肽段致敏的脾细胞重悬于 4 mL 无菌 PBS 中。
2. 分别向含有无关肽段、位点 I 和位点 IV 致敏的脾细胞的试管中加入终浓度为 0.025 μM、0.25 μM 和 2 μM 的 CFSE。
   注意：为实现均匀的 CFSE 标记，加入 CFSE 前应将每支试管倾斜约 45°，将染料加至液面稍上方的管壁处，随后立即轻轻涡旋混匀。此操作可确保最终获得平滑的直方图。CFSE 荧光强度存在批间差异及随储存时间变化的情况，因此在确定最佳使用浓度前，可能需要尝试不同剂量的 CFSE 进行优化。
   注意：CFSE 在浓度高于 5 μM 时具有毒性。
3. 将试管置于 37 °C 培养箱中孵育 15 分钟，每隔 5 分钟轻柔翻转一次。
4. 向每支试管中加入 3 mL 热灭活的 FBS 以终止 CFSE 反应，随后用无菌 PBS 补充至所需体积。
5. 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
6. 将沉淀细胞重悬于 12 mL 无菌 PBS 中，并重复步骤 5.5。

6. 目标脾细胞群体CFSE标记充分性/均一性的检测

1. 将沉淀的细胞重悬于 3 mL PBS 中。
2. 轻轻涡旋混匀各管。分别取 10 μL 的 CFSE^low、CFSE^{intermediate (int)} 和 CFSE^high 细胞悬液，加入含有 200 μL PBS 的 5 mL 圆底聚苯乙烯荧光激活细胞分选（FACS）管中。
3. 使用配备 488 nm 激光的流式细胞仪检测细胞。根据细胞的前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）特性设定淋巴细胞门，然后在 FL-1 通道中采集位于该淋巴细胞门内的 5000 个事件。
4. 在“亲代”CFSE⁺ 细胞群体内，进一步设置直方图门以识别 CFSE^low、CFSE^int 和 CFSE^high 亚群。
5. 确认三个门内的事件数相等或接近相等。如有必要，在第 7 节混合并注射靶向脾细胞至未致敏和已致敏小鼠之前，调整“来源”管中的细胞数量（步骤 6.1）。

7. 将CFSE标记的靶细胞注射至初始型与T-Ag致敏受体小鼠

1. 轻轻涡旋混合源管。将三种CFSE标记的细胞悬液按相等比例转移至一个新管中。
2. 用无菌PBS补足体积。
3. 在4 °C条件下，以400 × g 离心5分钟，沉淀细胞。用无菌PBS重悬细胞沉淀。
4. 使用血细胞计数板对台盼蓝染色的细胞进行计数，确保细胞活力至少为95%。
5. 调整体积，使每只受体C57BL/6小鼠通过尾静脉静脉注射（i.v.）接受1 × 10⁷个混合靶细胞/200 μL PBS。
   注意：注射间隔期间将细胞置于冰上保存。每次注射前轻轻混匀靶细胞。记录每只小鼠的确切注射时间，该时间将决定动物的安乐死时间点。在同一实验中，所有动物的体内细胞毒性反应持续时间必须保持一致。

8. 数据采集

1. 在注射CFSE标记的靶细胞后两小时或四小时，通过颈椎脱位法处死受体小鼠。
   注意：体内细胞毒性作用的持续时间可能因实验系统、靶抗原的免疫原性、脾脏中肽抗原特异性T_CD8细胞的预期丰度及其裂解功能的强弱等因素而有所不同。
2. 分别取出每只小鼠的脾脏，并按照步骤3.2−3.9进行单独处理。
3. 弃去上清液，将沉淀细胞重悬于3 mL PBS中。
   注意：在进行流式细胞分析前，务必在4 °C或冰上操作脾组织和细胞悬液，以防止体外继续发生细胞毒性作用。
4. 从每份处理后的脾细胞中转移约1×10⁷个细胞至洁净的FACS管中。
5. 使用配备488 nm激光器的流式细胞仪立即检测细胞。根据细胞的FSC和SSC特性圈选淋巴细胞门。
6. 识别CFSE^-的受体脾细胞和CFSE⁺的转移靶细胞。设置额外的门控，分别包含CFSE^low、CFSE^int和CFSE^high的靶细胞亚群。
7. 在FL-1通道中采集总共2000个CFSE^low事件。

9. 数据分析

1. 使用以下公式计算每种同源靶细胞群体的特异性裂解率：
   % 特异性细胞毒作用 =
   其中 x = T 抗原致敏小鼠中 CFSE^int/high 的事件数，y = T 抗原致敏小鼠中 CFSE^low 的事件数，a = 未致敏小鼠中 CFSE^int/high 的事件数，b = 未致敏小鼠中 CFSE^low 的事件数。
   注意： 在评估多种同源靶细胞群体特异性裂解的“三峰”细胞毒性实验中，不宜使用靶细胞频率进行计算。原因在于，同源靶细胞群体的频率不仅受无关对照细胞比例的影响，还受到其他同源靶脾细胞比例的影响。因此，为准确计算每种同源靶细胞群体（无论是 CFSE^int 还是 CFSE^high 细胞）相对于 CFSE^low 对照细胞的裂解情况，上述公式中应使用各门控内的事件数。

表1. 本实验方案中涉及的多肽。

蛋白抗原来源	肽表位	命名	序列	MHC I 限制性
SV401 Large T Ag2	T Ag206-215	位点 I	SAINNYAQKL	H-2Db
SV40 Large T Ag	T Ag223-231	位点 II/III	CKGVNKEYL	H-2Db
SV40 Large T Ag	T Ag404-411	位点 IV	VVYDFLKC	H-2Kb
SV40 Large T Ag	T Ag489-497	位点 V	QGINNLDNL	H-2Db
HSV-13 糖蛋白 B	gB498-505*	gB498-505	SSIEFARL	H-2Kb
LCMV4 糖蛋白	GP33-41*	GP33-41	KAVYNFATC	H-2Db
1Simian Virus 40
2Large Tumor Antigen
3Herpes Simplex Virus type 1
4Lymphocytic Choriomeningitis Virus
*用作无关肽

结果

图1：T细胞的代表性流式细胞荧光分析_CD8在存在或不存在nTreg细胞的情况下，针对T抗原衍生表位的介导性细胞毒性。 用对照肽段（位点I或位点IV）脉冲处理并用CFSE不同标记的靶向脾细胞，通过流式细胞术在未处理小鼠（左图）、PBS注射的T抗原致敏小鼠（中图）以及PC61（抗-CD25）注射（nTreg细胞耗竭）的T抗原致敏小鼠（右图）的脾脏中进行追踪。靶细胞的特异性杀伤百分比根据本方案中描述的公式计算，图中显示代表性数值。本图经Haeryfar许可采用。 等...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X)	Thermo Fisher Scientific	25200-056
ACK 裂解缓冲液	Thermo Fisher Scientific	A1049201
抗小鼠 CD25 抗体（克隆号 PC-61.5.3）	Bio X Cell	BE0012
抗小鼠 PD-1 抗体（克隆号 RMP1-14）	Bio X Cell	BE0146
CFSE	Thermo Fisher Scientific	C34554
DMEM (1X)	Thermo Fisher Scientific	11965-092
胎牛血清 (FBS)	Wisent Bioproducts	080-150	使用前需热灭活
GlutaMAX (100X)	Thermo Fisher Scientific	35050-061
HEPES (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	终浓度为 10 mM
MEM 非必需氨基酸溶液 (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich	P0781	储存液为 100X
大鼠 IgG1 抗体（克隆号 KLH/G1-2-2）	SouthernBiotech	0116-01	同型对照
大鼠 IgG1 抗体（克隆号 HRPN）	Bio X Cell	BE0088	同型对照
大鼠 IgG1 抗体（克隆号 TNP6A7）	Bio X Cell	BP0290	同型对照
大鼠 IgG2a 抗体（克隆号 2A3）	Bio X Cell	BP0089	同型对照
RPMI 1640 (1X)	Thermo Fisher Scientific	11875-093
丙酮酸钠 (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360-070	终浓度为 1 mM